Функциональные изображений вирусных транскрипции заводов с использованием 3D флуоресцентной микроскопии
Summary
Вирусная transcriptional фабрики являются дискретные структуры, которые обогащаются с клеточной РНК-полимераза II для увеличения вирусных генов транскрипции во время повторной активации. Здесь описан способ найти сайты активно переписывание вирусный хроматина в трехмерном пространстве ядерного сочетанием иммунофлюоресценции окрашивание и в situ гибридизация РНК.
Abstract
Хорошо известно, что пространственным и временным регулирования генов является неотъемлемой частью управляющих экспрессии генов надлежащего. Следовательно это бесценный понять, где и когда транскрипции проходит в рамках ядерных пространства и визуализировать отношения между episomes, инфицированных в пределах той же клетке ядра. Здесь, были иммунофлюоресценции (IFA) и РНК-рыба combinedto определить, активно переписывание episomes саркома Капоши связанные герпеса (KSHV). По окрашиванию KSHV задержка связанные ядерного антигена (LANA), можно найти, где существуют вирусных episomes в ядре. Кроме того путем разработки РНК-FISH зондов для региона Интрон вирусный гена, который выражается только во время продуктивной инфекции, транскриптов РНК могут быть расположены. С помощью этой комбинации молекулярной зондов, можно визуализировать Ассамблея крупных вирусный транскрипции заводов и анализа пространственной регуляции экспрессии вирусных генов во время возобновления KSHV. В том числе Пятнать антитела анти РНК-полимераза II, одно также можно визуализировать связь между агрегации РНК-полимераза II (RNAPII) и транскрипции KSHV во время повторной активации.
Introduction
Она становится все более очевидным, что пространственно-временных Организация ядра играет важную роль в модуляции экспрессии генов, тонко настроены у эукариот. Большинство тканей конкретные гены распределены по многим хромосом и должны регулироваться синхронно для того, чтобы реагировать на конкретные стимулы в скоординированной основе1. Клетки построить активных хроматина концентраторы (ACH) как способ объединения генов и их СНГ нормативные компоненты для конкретных космических ядерных1.
Также было продемонстрировано в различных исследованиях, что хотя ядро кажется очень густой и вязкой, биологически активные молекулы могут обходить ядро довольно быстро через распространение2. Вследствие этого эфемерного свойства большинство протеины дна binding «прыжок» от привязки сайта для привязки сайта, чувствуя их путь вокруг ядерной пространства, которая позволяет для высоко адаптивный и универсальный ядро2.
Несмотря на это динамическое поведение биомолекул в ядре, ядерная органов, без мембраны такие как (но не ограничиваясь) по-прежнему существуют ядрышко, тела Cajal и promyelocytic лейкоз ядерной органов (PML-NB). Именно с помощью различных механизмов, таких как тандем повторов ДНК (ядрышко), рРНК (ядрышко) и структурных белков, например проекта (тела Cajal) или ПМЛ белков (PML-NB), которые держат эти конструкции вместе3,4,5 . Эти структуры и другие общины как транскрипции фабрики служить строительные леса, которые не только увеличить местные концентрация необходимых компонентов, но также регулируют состав белков и нуклеиновых кислот в них в конечном итоге создать Центральный сайт для эффективного клеточных функций6.
Визуализация, когда и где ядерных структур форма обеспечивает большой объем информации для исследователей, изучая эпигенетики. С точки зрения вирусологии, возобновление латентно зараженных вирусами, например KSHV, значительно изменяет ландшафт ядра и распределение ядерных ферментов перенести транскрипции главным образом от клеточных генов вирусных генов, в конечном счете к производить полностью функциональный вирусного потомства7,8. Каким образом KSHV манипулировать клеточных генов выражение механизмы для содействия экспрессии вирусных генов? Такая информация могла бы также пролить свет на височной клеточных генов регулирующих механизмов.
Как и все другие Герпесвирусы KSHV имеет два жизненных циклов, называется литические репликации и задержки. KSHV главным образом находится в стадии задержки, в которой большинство вирусных генов замолчать выражения, за исключением задержки связанных генов9,10. Во время задержки, которое производит KSHV задержки связанные ядерного антигена (LANA), который конститутивно связывает вирусных геномов и тросов вирусный хроматина в человеческой хромосомы11. Из-за ЛАНЫ интимные отношения с вирусного генома можно использовать ИФА и DAPI пятно и найти, где вирусных episomes были связаны с принимающей хроматина.
Для изучения KSHV возобновление на уровне одного episome и ассоциации с другими вирусных episomes в инфицированной клетки, была разработана стратегия для обнаружения активно переписывание вирусный хроматина в situ . Соответственно Лана и IFA RNAPII с Интрон РНК-рыбы были объединены, генерируя РНК-FISH зондов, которые связывают регион Интрон (точное зонд последовательности можно найти в Идзумия лаборатории, самые последние публикации8) KSHV K-Rta ключевые вирусного белка, что необходимых и достаточных для KSHV реактивации можно было определить где транскрипция фактически принимает место8,11,12,13,14,15 . Этот Интрон РНК-рыба техника позволяет исследователям визуализировать, где мРНК транскрибируется непосредственно перед сращивания и экспортируются в цитоплазму16,17.
KSHV можно реактивировать с помощью различных химических раздражителей, включая phorbol эфиры, такие как 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (ДТС) и Ингибиторы гистоновых деацетилаз например натрия бутират, дополнительно KSHV может быть наведено возобновить, гиперэкспрессия Вирусная транскрипционный фактор, K-Rta19. Исследователи успешно увеличили эффективность KSHV оживления путем синхронизации циклов ячейки до вызывая реактивации18. Таким образом для этих конкретных исследований, клетки были синхронизированы с помощью блока двойной тимидина (протокол описано ниже) и инкубировали с ДТС и доксициклин (Dox) на короткое время. Doxycyline был использован потому что линия клетки, используемые в этих экспериментах доксициклин индуцибельной K-Rta кассету, который был клонирован от cDNA и не включают в себя регионе Интрон K-Rta. Хотя это можно возобновить только с помощью KSHV индуцированной K-Rta выражение, было доказано другими исследователями, что из-за целого ряда различных биохимических факторов K-Rta выражение только доказывает быть слабое оживление раздражители20. Комбинируя все эти и ограничивая инкубаций наркотиков для короткого периода времени прочной, но не слишком искусственным KSHV реактивирование был достигнут для воображения.
После маркировки Лана, RNAPII, K-Rta интронов и ДНК, как описано в этом документе, визуализация 3D флуоресценции была выполнена с помощью микроскопа деконволюция widefield. После обработки изображений программное обеспечение, пространственное распределение активных вирусных episomes может быть должным образом оценены. Используя эту технику, центральных вопросов относительно основополагающего характера формирования активных хроматина концентраторы и другие ядерные структуры могут быть изучены. Имея идентичные вирусных episomes в одну ячейку, которая обрабатывает те же регулирующие элементы могут представлять уникальный исследовательский инструмент для углубления понимания пространственно-временных гена регулирующих механизмов.
Ограничение визуализации несколько образцов клеток фиксированной в разное время точках характеризовать изначально динамической молекулярный процесс, что тонкие или небольших изменений в распределении флуоресценции незамеченными или считается незначительным. Это верно, если только в редких случаях, каждая клетка наблюдается отображает те же тонкие изменения. Таким образом полная пространственно-временных отношений активных вирусных транскрипции и другие ядерные структуры нельзя оценивать критически с использованием фиксированных визуализации. Для решения этих технических проблем, лучшим подходом является изображение живых клеток, которые обозначили вирусных episomes и следовать за расположение основных клеточных ферментов с течением времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть некоторые аспекты протокола, которые могут быть изменены с учетом необычных обстоятельств. Выбор буферов фиксации и permeabilization также могут быть изменены. Для фиксации буферов параформальдегид является также эффективным и этанола могут быть использованы для permeabilization.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национальными институтами здравоохранения Грант (R01-DE025985) и премией американской рак общества исследования ученый (RSG-13-383-ПДК). Эта работа также была поддержана грантов из Департамента сельского хозяйства США (2015-67015-23268 и 2014-67015-21787) и новые инициативы исследовательский грант от университета Калифорнии, Дэвис.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
