المناولة والمعالجة من الذكور ثعبان (أنغيلا أنغيلا) للنضج الهرموني وتجميد الحيوانات المنوية
Summary
بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية ونضوج ثعبان قد تحسنت خلال السنوات الأخيرة. توضح هذه المقالة بروتوكول أفضل متوفرة باستخدام تروج المشيمية البشرية (hCG) لتحريض نضوج والميثانول كريوبروتيكتانت.
Abstract
خلال السنوات الماضية، قد عملت مجموعات بحثية عديدة في تطوير وتحسين بروتوكولات جديدة للتعامل مع ثعبان والنضج. اعتبارا من بعد، أثبتت حقن أسبوعية تروج المشيمية البشرية (hCG) ماتوراتي الذكور بعد 5-6 أسابيع فقط من العلاج، وتنتج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة خلال عدة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام extenders مختلفة البروتوكولات تجميد الحيوانات المنوية، المنتجة والتبريد وذوبان مرات سابقا وصفت لثعبان. هنا، نحن إظهار أن الحل الموسع Tanaka´s يمكن استخدامها مباشرة للتسميد أو لنعد، مما يجعل غير الضرورية استخدام أنواع مختلفة من الحلول وتخفيف. وعلاوة على ذلك، يجعل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت هذا البروتوكول سهلة الاستخدام كما الميثانول سمية منخفضة وعدم تنشيط الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية لا تحتاج إلى أن cryopreserved فورا بعد إضافة كريوبروتيكتانت، ويمكن استخدامه بعد فترة طويلة يجري مذاب. وعلاوة على ذلك، أن عدد الحيوانات المنوية الحركة لا تزال مرتفعة بعد ذوبان الجليد على الرغم من أنها أقل من الحيوانات المنوية الطازجة. والهدف من هذا العمل لإظهار أفضل البروتوكول متاح لثعبان المناولة والنضج، وتجميد الحيوانات المنوية.
Introduction
على مدى السنوات ال 25 الماضية، وقد انخفض عدد ثعبان (أنغيلا أنغيلا) التوصل إلى الساحل الأوروبي اطراد 90% 1،،من23. وهناك العديد من العوامل التي تفسر هذا الانخفاض الحاد بما في ذلك التلوث، والالتهابات، وتدمير الإفراط في صيد الأسماك، والموئل. وكل هذا كان لها تأثير عميق على هذه الأنواع، مما أدى إلى إدراج ثعبان البحر الأوروبي في “الاتحاد الدولي” لصون الطبيعة (IUCN) قائمة ك 4الحرجة المهددة بالانقراض. ونتيجة لذلك، لا بد من تطوير تقنيات وبروتوكولات للتكاثر في الأسر.
نضوج ثعبان البحر الأوروبي في الأسر ويتحقق من خلال العلاج الهرموني 5،،من67 ولكن من الصعب إنتاج الأمشاج في كلا الجنسين لمزامنة 8. 10، توقيت النضج النهائي في الإناث على الرغم من أن تنمية جديدة الاندروجين يزرع أظهرت للتعجيل بتكون البويضات في الثعابين 9،لا يزال المتغير للغاية ويصعب التحكم في 11. ولذلك، التخزين القصير الأجل للحيوانات المنوية 12،،من1314 ونعد تقنيات ضرورية لإدارة التكاثر، مما يجعل مشيج المزامنة لا لزوم لها 8.
وقد وضعت تجميد الحيوانات المنوية ثعبان منذ عام 2003 15،16. تصميم الباحثين عدة بروتوكولات ناجحة باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أو الميثانول المنتجة 16،،من1718،،من1920. على الرغم من أن كلا البروتوكولين قد استخدمت بنجاح، استمرارية الخلية التي تم الحصول عليها من الحيوانات المنوية المذابة cryopreserved مع [دمس] أقل مع الميثانول 20،21. وعلاوة على ذلك، ثعبان البحر الحيوانات المنوية يتم تفعيلها على اتصال مع [دمس] ويتطلب معالجة الحيوانات المنوية أكثر مملة 19، وبالتالي الميثانول كريوبروتيكتانت أكثر ملاءمة للحيوانات المنوية ثعبان من [دمس].
هنا، والبروتوكول للتعامل مع المثلى والعلاج الهرموني من ثعبان البحر الأوروبي سيرد أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يكون البروتوكول تجميد الحيوانات المنوية ثعبان أفضل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت وبروتوكول لتقييم نوعية الحيوانات المنوية في هذه الأنواع أيضا وصف.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول عملية كاملة لنعد ثعبان نضوج والمناولة والحيوانات المنوية. تربية الشروط الموضحة هنا الأمثل للنضج السريع وإنتاج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة في هذه الأنواع 6،7،25. نجاح هذا البروتوكول للواسمات وعن الاس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المنشور كان يموله أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج إطار المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 642893 (إعجاب)، مكتب التكلفة (تكلفة العمل فا 1205، أقواجاميتي)، ومركز البحوث للتميز- 1476-4/2016/فكة.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
