Manutention et traitement des anguilles mâles sur l’Europe (Anguilla anguilla) pour Maturation hormonale et cryoconservation de sperme
Summary
Protocoles pour la cryoconservation de maturation et de sperme anguille d’Europe ont été améliorés ces dernières années. Cet article décrit le meilleur protocole disponible à l’aide de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour induire la maturation et le méthanol comme cryoprotectant.
Abstract
Au cours des dernières années, plusieurs groupes de recherche ont travaillé sur le développement et l’amélioration de nouveaux protocoles pour la manipulation de l’anguille européenne et de la maturation. En encore, des injections hebdomadaires de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) sont sont révélés maturate mâles après seulement 5-6 semaines de traitement, produire des volumes élevés de qualité de sperme pendant plusieurs semaines. En outre, protocoles de cryoconservation de sperme en utilisant différentes matières de charge, cryoprotecteurs et refroidissement et dégels ont été décrits précédemment pour l’anguille européenne. Ici, nous montrons que Tanaka´s la solution d’extension peut être directement utilisée pour la fertilisation ou pour la cryoconservation, ce qui rend inutile l’utilisation de différents types de solutions et dilutions. En outre, l’utilisation du méthanol comme un cryoprotecteur, ce protocole facile à utiliser comme méthanol a une toxicité faible et ne s’active pas le sperme. Le sperme n’a pas à être cryoconservés immédiatement après l’ajout de la cryoprotecteur, et il peut être utilisé longtemps après être décongelés. En outre, la motilité des spermatozoïdes est encore élevée après décongélation même s’il est inférieur à celui du sperme frais. Le but de ce travail est de montrer le meilleur protocole disponible pour l’anguille européenne, une maturation et une cryoconservation de sperme.
Introduction
Au cours des 25 dernières années, le nombre d’anguille européenne (Anguilla anguilla) arrivant sur les côtes européennes ont diminué régulièrement par 90 % 1,2,3. Il y a plusieurs facteurs qui expliquent cette baisse drastique, notamment la pollution, les infections, destruction d’habitat et de la surpêche. Tout cela a eu un effet profond sur cette espèce, conduisant à l’inscription de l’anguille européenne à l’Union internationale pour la liste de la Conservation de la Nature (UICN) comme en danger critique 4. Par conséquent, le développement des techniques et des protocoles pour la reproduction en captivité sont nécessaires.
La maturation de l’anguille européenne en captivité est obtenue par un traitement hormonal 5,6,7 , mais la production de gamètes chez les deux sexes est difficile à synchroniser 8. Même si le développement de nouveaux implants d’androgènes a montré pour accélérer l’ovogenèse chez les anguilles 9,10, le moment de la maturation finale chez les femmes est encore très variable et difficile à contrôler 11. Stockage à court terme de sperme 12,13,14 cryopreservation techniques et sont donc nécessaires pour gestion de reproduction, faire des gamètes synchronisation inutile 8.
Cryoconservation du sperme de l’anguille européenne a été développée depuis 2003 15,16. Plusieurs chercheurs ont conçu réussies protocoles utilisant le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou méthanol comme cryoprotecteurs 16,17,18,19,20. Bien que les deux protocoles ont été utilisées avec succès, la viabilité des cellules obtenues de sperme décongelé cryopréservé avec le DMSO est inférieure avec méthanol 20,21. En outre, sperme anguille est activée au contact de DMSO et exige plus fastidieux de manipulation de sperme 19, donc le méthanol est un cryoprotecteur plus adapté pour les spermatozoïdes de l’anguille européenne de DMSO.
Ici, le protocole de manipulation optimale et un traitement hormonal de l’anguille européenne est décrites ci-dessous. En outre, le meilleur protocole de cryoconservation de sperme anguille européenne à l’aide de méthanol comme un cryoprotecteur et un protocole pour l’évaluation de la qualité du sperme chez cette espèce seront également décrit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit le processus complet pour la cryoconservation de maturation, de manutention et de sperme anguille européenne. Les conditions d’élevage décrites ici sont optimales pour la maturation rapide et de la production de grands volumes de sperme de qualité dans cette espèce de7, 6,25. Le succès de ce protocole de cryoconservation et son utilisation possible pour la fécondation après décongélation dépend …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette publication a été financée par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’innovation des programmes en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 642893 (IMPRESS), le Bureau de coût (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) et le Centre d’Excellence en recherche- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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