हैंडलिंग और हार्मोनल परिपक्वता और शुक्राणु Cryopreservation के लिए पुरुष यूरोपीय ईल (एंगुइला एंगुइला) का उपचार
Summary
यूरोपीय मछली परिपक्वता और शुक्राणु cryopreservation के लिए प्रोटोकॉल पिछले वर्षों में सुधार किया गया है । यह आलेख cryoprotectant के रूप में परिपक्वता और मेथनॉल उत्प्रेरण के लिए मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) का उपयोग कर उपलब्ध सबसे अच्छा प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।
Abstract
पिछले वर्षों के दौरान, कई अनुसंधान समूहों के विकास और यूरोपीय मछली हैंडलिंग और परिपक्वता के लिए नए प्रोटोकॉल के सुधार पर काम कर रहा है । अभी तक के रूप में, मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन के साप्ताहिक इंजेक्शन (एचसीजी) maturate पुरुषों के उपचार के सिर्फ 5-6 सप्ताह के बाद साबित कर दिया है, कई हफ्तों के दौरान उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के उच्च मात्रा में उत्पादन । इसके अलावा, शुक्राणु cryopreservation प्रोटोकॉल अलग extenders, cryoprotectants और ठंडा और गल बार का उपयोग कर पहले यूरोपीय मछली के लिए वर्णित किया गया है । यहां, हम बताते है कि तनाका ´ एस भरनेवाला समाधान सीधे निषेचन के लिए या cryopreservation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समाधान और कमजोर पड़ने के विभिंन प्रकार के अनावश्यक उपयोग कर । इसके अलावा, एक cryoprotectant के रूप में मेथनॉल का उपयोग इस प्रोटोकॉल मेथनॉल कम विषाक्तता है और शुक्राणु को सक्रिय नहीं करता है के रूप में उपयोग करने के लिए आसान बनाता है । शुक्राणुओं को cryoprotectant के जोड़ के तुरंत बाद cryopreserved जाने की जरूरत नहीं होती है और इसे गल जाने के बाद लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, शुक्राणु गतिशीलता अभी भी गल के बाद उच्च हालांकि यह ताजा शुक्राणु की तुलना में कम है । इस काम का उद्देश्य यूरोपीय मछली हैंडलिंग, परिपक्वता, और शुक्राणु cryopreservation के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध प्रोटोकॉल दिखाने के लिए है ।
Introduction
पिछले 25 वर्षों से यूरोपीय तट पर पहुंचने वाले यूरोपीय ईल (एंगुइला एंगुइला) की संख्या में ९०% 1,2,3तक तेजी से कमी आई है । वहां कई कारकों है कि प्रदूषण, संक्रमण, मछली पकड़ने और आवास विनाश सहित इस कठोर गिरावट की व्याख्या कर रहे हैं । इस सब के सब इस प्रजाति पर गहरा असर पड़ा है, प्रकृति के संरक्षण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संघ पर यूरोपीय मछली के शामिल किए जाने के लिए अग्रणी (आईयूसीएन) सूची के रूप में महत्वपूर्ण खतरे में 4। नतीजतन, तकनीक और कैद में प्रजनन के लिए प्रोटोकॉल के विकास के लिए आवश्यक हैं ।
कैद में यूरोपीय मछली की परिपक्वता हार्मोनल उपचार द्वारा हासिल की है 5,6,7 लेकिन दोनों लिंगों में gametes का उत्पादन 8सिंक्रनाइज़ करने के लिए मुश्किल है । हालांकि नए एण्ड्रोजन प्रत्यारोपण के विकास के 9ईल में oogenesis में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है,10, महिलाओं में अंतिम परिपक्वता के समय अभी भी उच्च चर और 11को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. इसलिए, कम शुक्राणु की अवधि के भंडारण 12,13,14 और cryopreservation तकनीक प्रजनन प्रबंधन के लिए आवश्यक हैं, gamete तुल्यकालन अनावश्यक 8बना रही है ।
यूरोपीय मछली शुक्राणु के Cryopreservation २००३ 15,16के बाद से विकसित किया गया है । कई शोधकर्ताओं ने या तो dimethyl sulfoxide (DMSO) या मेथनॉल के रूप में cryoprotectants 16,17,18,19,20का उपयोग कर सफल प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया । हालांकि दोनों प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, DMSO के साथ गल शुक्राणु cryopreserved की प्राप्त सेल व्यवहार्यता मेथनॉल 20,21के साथ की तुलना में कम है । इसके अलावा, मछली शुक्राणु DMSO के साथ संपर्क पर सक्रिय है और अधिक थकाऊ शुक्राणु हेरफेर 19की आवश्यकता है, इसलिए मेथनॉल DMSO से यूरोपीय मछली शुक्राणु के लिए एक अधिक उपयुक्त cryoprotectant है ।
यहां, इष्टतम हैंडलिंग और यूरोपीय मछली के हार्मोनल उपचार के लिए प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित किया जाएगा । इस के अलावा, सबसे अच्छा यूरोपीय मछली शुक्राणु cryopreservation एक cryoprotectant और इस प्रजाति में शुक्राणु की गुणवत्ता के आकलन के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में मेथनॉल का उपयोग कर प्रोटोकॉल भी वर्णित किया जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल यूरोपीय मछली परिपक्वता, हैंडलिंग और शुक्राणु cryopreservation के लिए पूरी प्रक्रिया का वर्णन । यहां वर्णित पशुपालन की स्थिति तेजी से परिपक्वता और उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु की उच्च मात्रा के उत्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी Sklodowska के तहत वित्त पोषित-क्यूरी अनुदान समझौते नहीं ६४२८९३ (प्रभावित), लागत कार्यालय (लागत लड़ाई एफए १२०५, AQUAGAMETE), और उत्कृष्टता के अनुसंधान केंद्र- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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