Hantering och behandling av manliga europeisk ål (Anguilla anguilla) för hormonella mognad och spermier frysförvaring
Summary
Protokoll för europeisk ål mognad och spermier frysförvaring har förbättrats de senaste åren. Denna artikel beskriver det bästa protokollet som är tillgängliga med hjälp av humant koriongonadotropin (hCG) för att inducera mognad och metanol som frysskyddmedel.
Abstract
Under de senaste åren har har flera forskargrupper arbetat med utveckling och förbättring av nya protokoll för europeisk ål hantering och mognad. Som av ännu, har veckovisa injektioner av humant koriongonadotropin (hCG) visat för att cyter hanar efter bara 5-6 veckors behandling, producerar stora volymer av hög kvalitet spermier under flera veckor. Dessutom har spermier frysförvaring protokoll använder olika förlängare, cryoprotectants, kylning och upptining gånger tidigare beskrivits för europeisk ål. Här visar vi att Tanaka´s extender lösning kan användas direkt för befruktning eller för frysförvaring, att göra onödiga användningen av olika typer av lösningar och spädningar. Dessutom, användning av metanol som en frysskyddmedel gör detta protokoll lättanvänd eftersom metanol har låg toxicitet och aktiverar inte spermier. Spermierna behöver inte förvaras i fryst tillstånd omedelbart efter tillsats av frysskyddmedel och den kan användas länge efter att vara tinade. Dessutom är spermierörlighet fortfarande hög efter upptining även om det är lägre än för färsk sperma. Syftet med detta arbete är att visa de bästa tillgängliga protokollet för europeisk ål hantering, mognad och spermier frysförvaring.
Introduction
De senaste 25 åren har har antalet europeiska ålen (Anguilla anguilla) anländer till den europeiska kusten minskat stadigt med 90% 1,2,3. I området i närheten finns det flera faktorer som förklarar denna drastiska minskning inklusive föroreningar, infektioner, överfiske och livsmiljö förstörs. Allt detta har haft en djupgående effekt på denna art, vilket ledde till införandet av den europeiska ålen på den internationella unionen för naturvårdsunionen (IUCN) lista som kritiska utrotningshotade 4. Utvecklingen av tekniker och protokoll för reproduktion i fångenskap är således nödvändig.
Mognaden av den europeisk ål i fångenskap uppnås genom hormonell behandling 5,6,7 , men produktionen av könsceller hos båda könen är svårt att synkronisera 8. Även om utvecklingen av nya androgen implantat har visat för att påskynda oogenes i ål 9,är10, tidpunkten för slutliga mognad hos kvinnor fortfarande mycket varierande och svårt att kontrollera 11. Därför är kortvarig förvaring av sperma 12,13,14 och frysförvaring tekniker krävs för reproduktion förvaltning, att göra könsceller synkronisering onödiga 8.
Frysförvaring av europeisk ål spermier har utvecklats sedan 2003 15,16. Flera forskare konstruerade framgångsrika protokoll med hjälp av dimetyl sulfoxid (DMSO) eller metanol som cryoprotectants 16,17,18,19,20. Även om båda protokollen har använts framgångsrikt, är den erhållna cellviabiliteten tinade spermier fryst tillstånd med DMSO lägre än med metanol 20,21. Dessutom ål spermier aktiveras vid kontakt med DMSO och kräver mer tråkiga spermier manipulation 19, metanol är därför en mer passande frysskyddmedel för europeisk ål spermier än DMSO.
Här, kommer protokollet för optimal hantering och hormonell behandling av den europeiska ålen att beskrivas nedan. Utöver detta kommer också det bästa europeiska ål spermier frysförvaring protokoll använder metanol som en frysskyddmedel och ett protokoll för bedömning av spermiekvalitet hos denna art beskrivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver hela processen för europeisk ål mognad, hantering och spermier frysförvaring. Om djurhållning villkoren här är optimal för snabb mognad och produktion av stora volymer av hög kvalitet sperma i denna art 6,7,25. Framgången för frysförvaring protokollet och dess potentiella användning för befruktning efter upptining är kraftigt beroende av kvaliteten på färsk sperma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna publikation har finansierats av EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet under Marie Sklodowska-Curie bidragsavtalet ingen 642893 (IMPRESS), det COST-kontoret (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) och Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
