Håndtering og behandling af mandlig europæiske ål (Anguilla anguilla) for hormonelle modning og Sperm kryopræservering
Summary
Protokoller for europæiske ål modning og sperm kryopræservering er blevet forbedret i de seneste år. I denne artikel beskrives den bedste protokol tilgængelige ved hjælp af humant choriongonadotropin (hCG) for inducerende modning og methanol som kryoprotektant.
Abstract
I de seneste år, har flere forskergrupper arbejdet på udvikling og forbedring af nye protokoller for den europæiske ål håndtering og modning. Som af endnu, ugentlige injektioner af humant choriongonadotropin (hCG) har vist sig for at maturate hanner efter bare 5-6 ugers behandling, producerer store mængder af høj kvalitet sperm i flere uger. Derudover har sperm kryopræservering protokoller ved hjælp af forskellige extendere, cryoprotectants og nedkøling og optøning gange været tidligere beskrevet for europæiske ål. Her, viser vi at Tanaka´s extender løsning kan anvendes direkte, for befrugtning eller til kryopræservering, gør unødvendige brugen af forskellige typer af løsninger og fortyndinger. Desuden gør brug af methanol som en kryoprotektant denne protokol nem at bruge som methanol har lav toksicitet og ikke aktivere sperm. Sæden behøver ikke at blive befrugtede umiddelbart efter tilsætning af kryoprotektant, og den kan bruges længe efter at blive optøet. Derudover er sædkvalitet stadig høj efter optøning selv om det er lavere end frisk sæd. Formålet med dette arbejde er at vise den bedste tilgængelige protokol for europæisk ål, håndtering, modning og sperm kryopræservering.
Introduction
I de sidste 25 år, er antallet af europæiske ål (Anguilla anguilla) ankommer til den europæiske kyst faldet støt med 90% 1,2,3. Der er flere faktorer, der forklarer dette drastiske fald herunder forurening, infektioner, overfiskeri og levesteder ødelæggelse. Alt dette har haft en dybtgående indvirkning på denne art, fører til inddragelse af den europæiske ål på den internationale Union for bevarelse af naturen (IUCN) liste som kritisk truede 4. Udviklingen af teknikker og protokoller til reproduktion i fangenskab er derfor nødvendig.
Modning af den europæiske ål i fangenskab er opnået ved hormonbehandling 5,6,7 , men produktionen af mælke hos begge køn er vanskeligt at synkronisere 8. Selv om udviklingen af nye androgen implantater har vist sig for at accelerere oogenesen i ål 9,er10, timingen af endelige modning hos kvinder stadig meget variable og svær at styre 11. Kortvarig oplagring af sperm 12,13,14 og kryopræservering teknikker er derfor nødvendige for reproduktion forvaltning, hvilket gør gamet synkronisering unødvendige 8.
Kryopræservering af europæiske ål sæd er blevet udviklet siden 2003 15,16. Flere forskere designet vellykket protokoller ved hjælp af enten dimethylsulfoxid (DMSO) eller methanol som cryoprotectants 16,17,18,19,20. Selv om begge protokoller er blevet anvendt, er opnåede cellernes levedygtighed af optøet sæd befrugtede med DMSO lavere end med methanol 20,21. Desuden ål sæd er aktiveret på kontakt med DMSO og kræver mere kedelig sperm manipulation 19, methanol er derfor en mere passende kryoprotektant for europæiske ål sperm end DMSO.
Her, vil være beskrevne protokol til optimal håndtering og hormonel behandling af den europæiske ål. Ud over dette, den bedste europæiske ål sperm kryopræservering protokol bruger methanol som en kryoprotektant og en protokol for vurdering af sædkvalitet i denne art bliver også beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver den komplet proces for europæisk ål modning, håndtering og sperm kryopræservering. Dyrehold betingelser beskrevet her er optimal til hurtig modning og produktion af store mængder af høj kvalitet sædceller i denne arter 6,7,25. Protokollens kryopræservering og dets potentielle anvendelse for befrugtning efter optøning succes afhænger i høj grad kvaliteten af frisk sperm 26</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne publikation blev finansieret af den Europæiske Unions Horisont 2020 forskning og innovation-programmet under tilskudsaftalen Marie Sklodowska-Curie ingen 642893 (IMPRESS), COST-kontoret (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE), og Research Center of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
