세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축
Summary
비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.
Abstract
지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.
Introduction
세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈1내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성2. 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.
그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질5그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직—발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질9에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.
우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질13,14, 지 단백질9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다 . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.
MS 구조 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
메러디스 랩에서 연구 비 과학 대학 (펜실베니아 주립 대학)에서 제공 하는 시작 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 전문적인 기술 조언과 펜 스테이트 Proteomics와 질량 분석 핵심 시설, 대학 공원, PA, 대량 spectrometric 분석 수행 된 장비에 대 한 액세스에 대 한 박사 타 Laremore 감사 합니다.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
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