Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa
Summary
L’arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.
Abstract
Le lipoproteine sono costituenti importanti della busta delle cellule batteriche e potenti attivatori della risposta immunitaria innata dei mammiferi. Nonostante la loro importanza nella fisiologia cellulare e di immunologia, molto resta ancora da scoprire sulle forme di romanzo della lipoproteina, come essi sono sintetizzati e l’effetto delle varie forme su immunità dell’ospite. Per attivare studi approfonditi sulle lipoproteine, questo protocollo descrive un metodo per l’arricchimento della lipoproteina batterica e preparazione del N-terminale triptico lipopeptidi per determinazione strutturale di matrix-assisted laser desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS). Espandendo una consolidata fase di Triton X-114 metodo per l’estrazione della lipoproteina e arricchimento dalla membrana cellulare batterica di partizionamento, il protocollo include ulteriori passaggi per rimuovere i contaminanti non-lipoproteina, aumentano il rendimento della lipoproteina e purezza. Poiché le lipoproteine sono comunemente usate nelle analisi di recettori Toll-like (TLR), è fondamentale innanzitutto caratterizzano la struttura del N-terminale di MALDI-TOF MS. qui, viene presentato un metodo per isolare peptidi idrofobi concentrati arricchiti in N-terminale lipopeptidi adatti per l’analisi diretta di MALDI-TOF MS/MS. lipoproteine che sono stati separati da sodio solfato elettroforesi dodecilica del Gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) sono trasferito ad una membrana di nitrocellulosa, digeriti in situ con tripsina, in sequenza lavata per rimuovere peptidi triptici polar e infine eluito con cloroformio-metanolo. Quando accoppiato con MS dei peptidi trypsinized più polari da soluzioni di lavaggio, questo metodo fornisce la capacità di identificare la lipoproteina e caratterizzano la sua estremità N-terminale in un singolo esperimento. Formazione del complesso di sodio intenzionale può essere impiegato anche come strumento per promuovere più spettri di frammentazione strutturalmente ben informato. In definitiva, arricchimento delle lipoproteine e determinazione delle loro strutture di N-terminale permetterà studi più approfonditi su questa onnipresente classe di proteine batteriche.
Introduction
Lipoproteine batteriche sono caratterizzate da una N-terminale del lipido-modificato cisteina conservato che le ancore il dominio globulare proteina alla superficie della membrana cellulare. Essi sono distribuiti universalmente nei batteri, che costituiscono il 2 e il 5% di tutti i geni cellulari all’interno di un tipico genoma1. Lipoproteine giocano un ruolo critico in un’ampia varietà di processi cellulari, tra cui l’assorbimento di nutrienti, trasduzione del segnale, assemblaggio di complessi proteici e nel mantenimento delle cellule busta integrità strutturale2. Batteri patogeni, lipoproteine servono come fattori di virulenza3,4. Durante un’infezione, riconoscimento del N-terminale lipopeptidi di recettori Toll-like (TLR) 2 incita una risposta immunitaria innata per rimuovere gli agenti patogeni d’invasione. A seconda dello stato di acilazione del N-terminale, le lipoproteine sono generalmente riconosciute da alternativo TLR2 heterodimeric complessi. TLR2-TLR1 riconosce N-acilato lipopeptidi, mentre TLR2-TLR6 lega lipopeptide gratis termini α-amminico. Una volta legato, le vie di segnalazione convergono per indurre la secrezione di citochine proinfiammatorie3,4.
Era precedentemente pensato che le lipoproteine da batteri Gram-positivi erano diacylated e quelli da batteri gram-negativi erano triacylated, differendo in assenza o in presenza di un acido grasso ammide-collegato sul residuo di cisteina di N-terminale conservato. Questa ipotesi è stata sostenuta dalla mancanza di sequenza ortologhi nei genomi Gram-positivi a Lnt, il gram-negativi N-acil transferasi che forma triacylated lipoproteine5. Tuttavia, recenti studi hanno rivelato lipoproteina triacylation in Gram-positivi Firmicutes tale mancanza lnt, come pure tre nuove strutture della lipoproteina N-terminale, definiti il peptidil, lyso e N –acetile moduli6,7 ,8. Questi risultati sollevano domande sulle forme possibili della lipoproteina ancora scoperto, insieme a domande fondamentali su come sono fatte queste lipoproteine romanzo e quali finalità fisiologiche o vantaggio impartire le varie forme. Inoltre, dimostrano chiaramente l’impossibilità attuale di genomica per predire la struttura della lipoproteina. Infatti, recentemente abbiamo identificato una nuova classe di transferasi di N-acil lipoproteina, chiamato Lit, da Enterococcus faecalis e bacillo saguaro che rende lyso-modulo lipoproteine9. Questo indica la necessità di verificare sperimentalmente la struttura della lipoproteina, che può essere difficile a causa della loro natura estremamente idrofobica e limitate metodi disponibili per caratterizzare la loro struttura molecolare.
Per facilitare gli studi sull’induzione della lipoproteina della risposta immunitaria ospite, come pure la determinazione strutturale di N-terminale, abbiamo adattato parecchi protocolli precedentemente descritta al fine di purificare le lipoproteine batteriche e preparare il trittico N-terminale lipopeptidi per analisi mediante MALDI-TOF MS6,10,11,12. Le lipoproteine sono arricchite utilizzando una consolidata fase di Triton X-114 (d’ora in poi denominato tensioattivo o TX-114) metodo, con ottimizzazione per rimuovere contaminanti non-lipoproteine e aumentare la resa della lipoproteina di partizionamento. Queste lipoproteine sono adatte per uso diretto in saggi TLR o per ulteriore purificazione da SDS-PAGE. Per MALDI-TOF MS, trasferimento delle lipoproteine di membrana di nitrocellulosa fornisce un’impalcatura per efficiente in situ digestione della tripsina, lavaggio e successiva eluizione dalla superficie della membrana, con conseguente altamente purificato lipopeptidi N-terminale. Nitrocellulosa è stata indicata per facilitare la manipolazione del campione e migliorare la copertura di sequenza per i peptidi altamente idrofobi da proteine integrali di membrana13,14, così come le lipoproteine9,10 . Il metodo ha il vantaggio aggiuntivo di frazionamento peptidi basati su polarità, in modo che soluzioni di lavaggio intermedio possono essere analizzati per identificazione di proteine di alta fiducia simultaneamente con determinazione strutturale di N-terminale in un singolo esperimento . Questo protocollo in modo univoco sodio intenzionale caratteristiche del complesso formazione per promuovere la frammentazione di ioni di padre verso gli ioni dehydroalanyl corso MS/MS, aiutando nella mansione strutturale dello stato N– acilazione. N-terminale è sia la caratteristica più variabile e chiave relazionata al riconoscimento TLR delle lipoproteine. Presi insieme, questo protocollo ha permesso studi intensivi e riproducibili sulle lipoproteine, con le singole fasi di purificazione e determinazione strutturale di MALDI-TOF MS facilmente adattato a seconda l’obiettivo generale dell’esperimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di questo documento descrive due distinte fasi di caratterizzazione della lipoproteina: determinazione di partizionamento e strutturale mediante MALDI-TOF MS di fase di arricchimento di TX-114. Durante l’estrazione di TX-114, ulteriore centrifugazione rimuove contaminanti proteine che precipitano durante questo processo, seguito da precipitazione di acetone per produrre lipoproteine altamente arricchite. Limitando la scala di ogni preparazione a 15 mL vale la pena di cellule, parecchi campioni possono esser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca nel laboratorio di Meredith è stata sostenuta dai fondi di avvio forniti da Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Ringraziamo il Dr. Tatiana Laremore per consulenza di tecnico esperti e accesso alle apparecchiature presso la Penn State proteomica e funzione di spettrometria di massa, University Park, PA, dove sono state effettuate analisi di spettrometrihe di massa.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
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