CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여
Summary
클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.
Abstract
유망한 게놈 편집 플랫폼으로 서 CRISPR/Cas9 시스템 특히 transgenes 대상된 통합에 대 한 효율적인 유전자 조작에 대 한 큰 잠재력이 있다. 그러나, 동종 재결합 (HR)의 낮은 효율과 비 동종 끝 결합 (NHEJ)의 다양 한 indel 돌연변이 때문-기반 전략 비 분할 셀, vivo에서 게놈 남아 편집에 큰 도전. 여기, 우리가 설명 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-정확한 타겟 통합 효율적인 vivo에서 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로. 이 시스템에는 기증자와 타겟된 게놈 벡터 포함 하 상 동 팔 (~ 800 bp) 단일 가이드 RNA (sgRNA) 대상 시퀀스는 CRISPR/Cas9에 의해 죽 습에 의해 형벌. 이 HMEJ 기반 전략 마우스 zygotes, 뿐만 아니라 vivo에서hepatocytes에 효율적인 transgene 통합을 달성 한다. 또한, HMEJ 기반 전략은 hepatocytes에서 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파) 돌연변이의 수정에 대 한 효율적인 접근 방식을 제공 하 고 파를 구출-결핍 유발 간부 쥐. 함께, 통합 대상에 초점을 맞추고,이 HMEJ 기반 전략 유전자 변형된 동물 모델 및 타겟된 유전자 치료의 세대를 포함 하는 응용 프로그램의 다양 한 유망 도구를 제공 합니다.
Introduction
정확 하 고 타겟 게놈 편집 하는 것은 종종 생산 하는 유전자 변형 동물 모델과 임상 치료 필요 합니다. 효율적인 타겟된 게놈 아연 손가락 nuclease (ZFN), 같은 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs), 편집에 대 한 다양 한 전략을 개발 하기 위해 많은 노력 했다 및 CRISPR/Cas9 시스템. 이러한 전략 타겟된 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 게놈에서 만들고 동종 재결합 (HR)1,2, microhomology-중재 끝 결합 (MMEJ)3 등 본질적인 DNA 복구 시스템 , 4 , 5, 그리고 비 동종 끝 결합 (NHEJ)6,,78 transgenes1,9의 타겟된 통합을 유도 하 라. 시간 기반 전략은 현재 가장 일반적으로 사용 되는 셀 라인에 매우 효율적 이지만 비 분할 셀 후반 S/g 2 단계에서 제한 된 그것의 발생 때문에 쉽게 액세스할 수 없는 접근을 편집 하는 게놈. 따라서, 시간 기반 전략 vivo에서 게놈 편집에 대 한 적용 되지 않습니다. 최근, NHEJ 기반 전략에 대 한 효율적인 유전자 노크 마우스 조직8에서 개발 되었다. 그럼에도 불구 하 고, NHEJ 기반 방법 일반적으로 접합, 어렵게 정확한 게놈 편집, 프레임에 융합 유전자8를 구성 하려고 할 때 특히 생성에서 indels를 소개 합니다. MMEJ 기반 대상된 통합은 정확한 게놈 편집 가능 합니다. 그러나, 그것은 단지 겸손 하 게 이전 보고서5대상된 통합 효율성 증가. 따라서 vivo에서 정확한 타겟된 통합의 효율성 개선 시급히 필요 광범위 한 치료 응용 프로그램3합니다.
최근에 출판 된 작품에서 우리 시연 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-모든 보고 전략 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서10최고의 타겟된 통합 효율을 보여준 전략을 기반으로. 여기, 우리는 HMEJ 시스템의 설립을 위한 프로토콜을 설명 하 고 또한 관심과 기증자의 유전자를 대상으로 단일 가이드 RNA (sgRNA) 벡터의 벡터 은닉 sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 (그림 1)의 . 이 프로토콜에서 우리 또한 vivo에서조직 대상된 통합에 대 한 DNA 노크에서 마우스와 간단한 단계의 세대에 대 한 자세한 내용은 설명합니다. 또한, HMEJ 기반 전략의 개념 증명 연구 Fah 돌연변이 수정 하 고 구조 파-/- 간 실패 마우스, 더 치료 잠재력을 공개 하는 기능을 설명 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HMEJ 기증자 플라스 미드의 건축에서 가장 중요 한 단계는: (1) 높은 DNA 분열 효율과 낮은 거리 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon, 및 (2) 적절 한 건설 HMEJ 기증자의 간의 sgRNA의 선택. CRISPR/Cas9-중재 분열 (sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 포함) 모두 transgene 기증자 벡터에 타겟된 게놈은 효율적이 고 정확한 타겟된 통합에 필요한 vivo에서. HMEJ 기반 방법을 사용 하 여 노크에서 쥐의 세대의 가장 중?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CAS 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (XDB02050007, XDA01010409), 국가 하이테크 R & D 프로그램 (863 프로그램; 2015AA020307), 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (NSFC 부여 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), 중국 청소년 천 재능 프로그램 (HY), 휴식 프로젝트를 통해 중국 과학 아카데미의, 상하이 시 위원회의 과학 기술 프로젝트 (HY에 16JC1420202), 과학과 기술의 중국 (대부분; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
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