Summary

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Abstract

Bir umut verici genom düzenleme platformu olarak, CRISPR/Cas9 sistem transgenes hedeflenen entegrasyonu için özellikle verimli genetik manipülasyon için büyük potansiyele sahiptir. Ancak, homolog rekombinasyon (HR) düşük verimliliğini ve çeşitli Indel mutasyonlar (NHEJ) katılmadan homolog olmayan sonu nedeniyle-sigara bölen hücreleri, in vivo genom kalır düzenleme stratejileri büyük bir meydan okuma dayalı. Burada, biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-esaslı CRISPR/Cas9 sistem verimli vivo içinde kesin hedeflenen tümleştirme için. Bu sistemde, vektör hedeflenen genom ve donör içeren homoloji silah (~ 800 bp) dizileri CRISPR/Cas9 tarafından i ciddi tek Kılavuzu RNA (sgRNA) hedef tarafından çevrili. Bu HMEJ tabanlı strateji verimli transgene Tümleştirme fare zigotları yanı sıra tetkikine vivo içindeelde eder. Ayrıca, bir HMEJ tabanlı strateji fumarylacetoacetate hidrolaz (Fah) mutasyon tetkikine düzeltilmesi için verimli bir yaklaşım sunuyor ve Fahkurtarır-eksikliği bağlı Karaciğer yetmezliği fareler. Birlikte ele alındığında, odaklanan entegrasyonu hedefleyen, bu HMEJ tabanlı strateji uygulamaları, üretimi hedeflenen gen terapileri ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri de dahil olmak üzere çeşitli için umut verici bir araç sağlar.

Introduction

Kesin, hedeflenen genom düzenleme kez klinik tedavi ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri üretmek için gereklidir. Düzenleme, çinko parmak nükleaz (ZFN), gibi transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs), verimli hedeflenen genom için çeşitli stratejiler geliştirmek için çok çaba yapılmış ve CRISPR/Cas9 sistemleri. Bu stratejiler hedeflenen DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) genom oluşturmak ve homolog rekombinasyon (HR)1,2, microhomology-aracılı sonunda (MMEJ)3 katılma gibi içsel DNA onarım sistemleri yararlanmak , 4 , 5ve homolog bitiş transgenes1,9hedeflenen Tümleştirme ikna etmek için (NHEJ)6,7,8 katılmadan. İK tabanlı strateji şu anda en sık kullanılan düzenleme yaklaşımı, hücre hatlarında çok etkili, ama geç S/G2 aşamasında kısıtlı onun oluşumu nedeniyle olmayan bölme hücrelere kolayca erişilebilir değil genom olduğunu. Böylece, insan kaynakları tabanlı strateji genom vivo içinde düzenleme için geçerli değildir. Son zamanlarda, NHEJ tabanlı strateji verimli gen knock bileşeninde fare doku8için geliştirilmiştir. Yine de, NHEJ tabanlı yöntem genellikle hassas genom düzenleme, özellikle çerçeve füzyon genlerin8oluşturmak çalışırken oluşturmak üzere kavşaklar, indels sunar. Hedeflenen bütünleşmesidir kesin genom düzenleyebilen MMEJ tabanlı. Ancak, sadece mütevazi önceki raporlar5hedeflenen entegrasyon verimliliği artırır. Bu nedenle, kesin hedeflenen entegrasyon içinde vivo verimliliğini artırmak acilen geniş tedavi edici uygulamaları3için gereklidir.

Kısa bir süre önce bir eser bulunmaktadır (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı sonunda gösterdi-strateji, tüm bildirilen stratejileri vitro ve in vivo10içinde en yüksek hedefli entegrasyon verimliliği gösterdi dayalı. Burada, biz HMEJ sisteminin kurulması için bir iletişim kuralı tanımlamak ve aynı zamanda faiz ve donör gen hedefleme tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) vektörel çizimler inşaat vektörler barındıran sgRNA hedef siteleri ve ~ 800 bp homoloji silah (şekil 1) . Bu protokol için biz de ayrıntılı adımlar için hedeflenen doku içinde vivoWuppertal’de DNA çakma fareler ve kısa adımlar oluşturmada açıklar. Ayrıca, HMEJ tabanlı strateji bir kanıtı-of-concept çalışma Fah mutasyon düzeltmek ve daha fazla terapötik potansiyelini ortaya Fah– / – Karaciğer yetmezliği fare, kurtarmak için onun yetenek gösterdi.

Protocol

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Shanghai Enstitüleri tarafından biyolojik bilim (CA) için onaylanmıştır. 1. donör plazmid tasarımını SgRNA seçimi Online CRISPR tasarım araçları hedef bölge11,12,13,14,15sgRNAs tahmin etme…

Representative Results

Fare embriyo genom HMEJ tabanlı düzenleme: HMEJ tabanlı yöntemi çakma verimliliğini fare zigotları tanımlamak için biz Cas9 mRNA, p2A-mCherry muhabir gene Cdx2 son kodonu ile sigorta için tasarlanmı Cdx2 gen ve HMEJ donör fare zigotları hedefleme sgRNA teslim gen (Şekil 2A). Blastokistlerin kültür içine enjekte zigotları geliştirdi. Çakma etkinliğini değerlendirmek için mCherry floresa…

Discussion

HMEJ donör plazmid yapımında en önemli adım vardır: (1) yüksek DNA bölünme verimlilik ve düşük arasındaki mesafeyi sgRNA kesme makinası ve kodonu, HMEJ donör (2) uygun inşası ile sgRNA yelpazesi. CRISPR/Cas9-aracılı bölünme (sgRNA hedef siteleri ve ~ 800 bp homoloji silah içeren) her iki transgene donör vektör Tarih ve hedeflenen genom verimli ve hassas hedeflenen entegrasyon için gerekli içinde vivo. Çakma HMEJ tabanlı yöntemi kullanma fare nesil en kritik adımlar şunlardır: (1) …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser CAS stratejik öncelik araştırma programı (XDB02050007, XDA01010409), ulusal Hightech R & D programı (863 Program; 2015AA020307), Çin Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (verir NSFC 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Çin Gençlik bin yetenekleri programı (için HY), ara Çin bilim, Shanghai şehir Komitesi, bilim ve teknoloji Projesi (16JC1420202 HY için), Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (çoğu; 2016YFA0100500).

Materials

pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

References

  1. Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  2. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  3. Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
  4. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  5. Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
  6. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
  7. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
  8. Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  10. Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
  11. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
  12. Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
  13. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
  14. Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
  15. Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  18. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  19. Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
  20. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  21. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
  22. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  23. Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
  24. Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).

Play Video

Cite This Article
Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

View Video