CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi
Summary
Den klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner/CRISPR associerade protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet ger ett lovande verktyg för genteknik och öppnar upp möjligheten att riktade integration av transgener. Vi beskriver en homologi-medierad slutet att gå (HMEJ)-baserat strategi för effektiv DNA riktade integration i vivo och riktade genterapi med hjälp av CRISPR/Cas9.
Abstract
Som en lovande genomet redigering plattform har CRISPR/Cas9 systemet stor potential för effektiv genmanipulation, särskilt för riktade integration av transgener. På grund av den låga verkningsgraden för homolog rekombination (HR) och olika ditsatta mutationer av icke-homolog slutet att gå (NHEJ)-baserade strategier i icke-dela celler, i vivo genomet redigering fortfarande en stor utmaning. Här, vi beskriver en homologi-medierad slutet att gå (HMEJ)-baserade CRISPR/Cas9-system för effektiv i vivo exakt riktade integration. I detta system, riktade genomet och givaren vektor innehållande homologi armar (~ 800 bp) flankerad av samma guide RNA (sgRNA) mål sekvenser klyvs av CRISPR/Cas9. Denna HMEJ-baserade strategi uppnår effektiva transgenens integration i mus zygoter, liksom i hepatocyter i vivo. Dessutom en HMEJ-baserad strategi erbjuder en effektiv metod för korrigering av fumarylacetoacetathydrolas hydrolas (Fah) mutation i hepatocyterna och räddar Fah-brist inducerad leversvikt möss. Sammantaget med fokus på riktade integration, denna HMEJ-baserade strategi ger ett lovande verktyg för en mängd applikationer, inklusive generationen genmodifierade djurmodeller och riktade genterapi.
Introduction
Exakt, riktade gen editering krävs ofta för att producera genetiskt modifierade djurmodeller och kliniska behandlingar. Mycket arbete har gjorts för att utveckla olika strategier för effektiv riktad genomet redigering, såsom zink finger nukleotid (ZFN), transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs), och CRISPR/Cas9-system. Dessa strategier skapa riktade DNA dubbel-strand raster (DSB) i genomet och utnyttja inneboende DNA reparation system, såsom homolog rekombination (HR)1,2, microhomology-medierad slutet att gå (MMEJ)3 , 4 , 5, och icke-homolog slutet att gå (NHEJ)6,7,8 för att inducera riktade integration av transgener1,9. HR-baserade strategin är för närvarande den vanligaste genomet redigering tillvägagångssätt som är mycket effektiv i cellinjer, men inte lättillgängliga för icke-dela celler på grund av dess begränsade förekomst i den sena S/G2-fasen. HR-baserade strategin gäller således inte för i vivo gen editering. Nyligen, den NHEJ-baserade strategin utvecklades för effektiv gen knock-in i musen vävnader8. Metoden NHEJ-baserade införs dock vanligtvis indels knytpunkter, vilket gör det svårt att generera exakt gen editering, särskilt när man försöker konstruera i-frame fusion gener8. MMEJ-baserade riktade integration kan exakt gen editering. Men ökar det bara blygsamt riktade integration effektiviteten i tidigare rapporter5. Förbättring av exakt riktade integration i vivo effektivitet behövs därför snarast för breda terapeutiska tillämpningar3.
I ett nyligen publicerat arbete, vi visat en homologi-medierad slutet att gå (HMEJ)-baserat strategi, som visade den högsta riktade integration effektiviteten i alla rapporterade strategier både in vitro- och in-vivo10. Här beskriver vi ett protokoll för etableringen av det HMEJ systemet, och även byggandet av singel-guide RNA (sgRNA) vektorerna inriktning genen av intresse och givaren vektorer hysande sgRNA inriktade på områden och ~ 800 bp homologi vapen (figur 1) . I detta protokoll beskriver vi också de detaljerade anvisningarna för generering av DNA inpressning möss och korta steg för riktade integration i vävnader i vivo. Dessutom visat en proof-of-concept studie av HMEJ-baserade strategi sin förmåga att korrigera Fah mutation och rädda Fah– / – leversjukdom misslyckande möss, vilket ytterligare avslöjade dess terapeutiska potential.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska steg i byggandet av HMEJ givare plasmider är: (1) val av sgRNA med hög DNA klyvning effektivitet och låga avståndet mellan sgRNA skärande webbplats och stop kodon, och (2) korrekt uppförande av HMEJ givare. CRISPR/Cas9-medierad klyvning på båda transgenens givare vektor (innehållande sgRNA inriktade på områden och ~ 800 bp homologi armar) och riktade genomet är nödvändiga för effektiv och exakt riktade integration invivo. De mest kritiska steg av generation av inpressning möss me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av CAS strategiska prioriterade Research Program (XDB02050007, XDA01010409), den nationella Hightech R & D Program (863 Program; 2015AA020307), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (NSFC beviljar 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Kina Youth tusen talanger Program (att HY), Break genom projektet av kinesiska vetenskapsakademin, projektet Shanghai City kommittén för vetenskap och teknik (16JC1420202 till HY), ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (de flesta; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
