Absolut kvantificering af mikroRNA plasmaniveauer i Cynomolgus aber, ved hjælp af kvantitative Real-time Reverse transkription PCR
Summary
Denne rapport beskriver en protokol til måling af de absolutte niveauer af plasma miRNA, ved hjælp af kvantitative real-time reverse transkription PCR, med eller uden forudgående forstærkning. Denne protokol giver bedre forståelse af mængden af plasma miRNAs og giver mulighed for kvalitativ vurdering af tilsvarende data fra forskellige undersøgelser eller laboratorier.
Abstract
RT-qPCR er en af de mest almindelige metoder til at vurdere individuelle mål miRNAs. MiRNAs niveauer måles generelt i forhold til en kontrolprøve. Denne tilgang er relevant for behandlingen af fysiologiske ændringer i gen expression målværdier. Men absolut kvantificering ved hjælp af bedre statistisk analyse er at foretrække frem for en omfattende vurdering af gene expression niveauer. Absolut kvantificering er ikke stadig i fælles brug. Denne rapport beskriver en protokol til måling af de absolutte niveauer af plasma miRNA, ved hjælp af RT-qPCR, med eller uden forudgående forstærkning.
En fast volumen (200 µL) af EDTA-plasma blev udarbejdet af blod indsamlet fra den femoralis vene af bevidst cynomolgus aber (n = 50). Total RNA blev udvundet ved hjælp af kommercielt tilgængelige system. Plasma miRNAs var kvantificeres ved sonde-baserede RT-qPCR assays, som indeholder miRNA-specifikke frem/tilbage PCR primer og sonde. Standard kurver for absolut kvantificering blev genereret ved hjælp af kommercielt tilgængelige syntetisk RNA-oligonukleotider. En syntetisk cel-miR-238 blev brugt som en ekstern kontrol til normalisering og kvalitet vurdering. De miRNAs, der viste kvantificering cyklus (Cq) værdier over 35 var pre forstærket før qPCR trin.
Blandt de 8 miRNAs undersøgt, miR-122, miR-133a og miR-192 var påviselige uden forudgående forstærkning, miR-1, miR-206 og miR-499a kræves forudgående forstærkning på grund af deres lave udtryk niveauer. MiR-208a og miR-208b var ikke detectable selv efter pre forstærkning. Prøve behandling effektivitet blev evalueret af Eva værdierne af de spidse cel-miR-238. I denne analyse metode, tekniske variation blev anslået til at være mindre end 3-fold og den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) var 102 kopi/µL, for de fleste af de undersøgte miRNAs.
Denne protokol giver et bedre skøn over mængden af plasma miRNAs, og giver mulighed for kvalitetsvurdering af tilsvarende data fra forskellige undersøgelser. I betragtning af det lave antal miRNAs i kropsvæsker, før forstærkning er nyttigt at forbedre afsløring af dårligt udtrykt miRNAs.
Introduction
Et stigende antal undersøgelser har været at udforske MicroRNA (miRNAs) som biomarkører for diagnose og prognose af kræft, eller overvågning og påvisning af andre sygdomme i kvalitetsdata og kliniske undersøgelser1,2,3 . Kvantitative real-time reverse transkription PCR (RT-qPCR) er en af de mest almindelige metoder anvendt til at vurdere individuelle mål miRNAs, fordi denne teknik er mere følsomme end microarray4 og RNA sekventering baseret platforme5. I almindelighed, er miRNA udtryk målt i forhold til en referenceprøve benytter den ΔCq metode6. Denne tilgang er relevant for at undersøge fysiologiske ændringer i gen expression målværdier. Relative kvantificering af cirkulerende miRNAs har dog begrænset nytte på grund af deres små mængder. Derudover gør tekniske variation det vanskeligt at sammenligne resultaterne fra forskellige undersøgelser, fordi forskellige laboratorier tilpasse RT-qPCR eksperimentelle protokoller forskelligt, hvilket fører til strid eller endda modstridende resultater fra forskellige studier7.
I lyset af de bekymring, der er nævnt ovenfor, kan absolut kvantificering være mere egnet til vurdering af de små mængder af miRNAs i kropsvæsker. Den absolutte kvantificering metode bruger en standardkurve genereret af kendte koncentrationer af syntetisk RNA-oligonukleotider, der er identiske i rækkefølge med de tilsvarende mål miRNA8. Sundheds- og miljømæssige Sciences Institute (HESI) tekniske udvalg på genomforskning for nylig foretaget omfattende undersøgelser for at sammenligne resultaterne af absolutte målinger af plasma miRNAs, på tværs af flere forsøgssteder. Resultaterne viste, at ved hjælp af en standardprotokol for den absolutte kvantitering af miRNAs viste sammenlignelige resultater på tværs af flere test sites9. RT-qPCR assay metode beskrevet i den nuværende undersøgelse er næsten identisk med den HESI standardprotokol, som indeholder multipleksede analyse af flere miRNA mål, og før forstærkning til støtte påvisning af lav udtryk miRNAs.
I denne undersøgelse, en fast volumen (200 µL) af EDTA-plasma fremstillet af blod indsamlet fra den femoralis vene af bevidst cynomolgus aber (n = 50) blev brugt10. Følgende protokol beskriver proceduren for udarbejdelse af plasmaprøver, udvinding af miRNA og RT-qPCR, herunder pre forstærkning. Endnu vigtigere, er yderligere tekniske oplysninger om protokollen medtaget, således at target miRNAs i prøverne mængde kan valideres i kombination med en velkvalificeret proces. Først, Standardkurven for hver miRNA blev valideret for sin individuelle registreringsområde, før dens kvantificering i biologiske prøver. Andet, kvaliteten af den nuværende metode blev grundigt evalueret ved hjælp af Cq værdier af et eksternt objekt (cel-miR-238). Derfor, denne platform giver mere informative og pålidelige data for at sammenligne resultaterne fra forskellige undersøgelser eller laboratorier.
Profiler af 8 miRNAs er medtaget i denne betænkning som repræsentative resultater fra analysen metode beskrevet her. Disse miRNAs er blevet foreslået som mulige sikkerhed biomarkører forbundet med vævsskade at leveren (miR-122 og miR-192), hjerte (miR-1, miR-208a, miR-208b og miR-499a) og skeletmuskulatur (miR-133a og miR-206) i gnavere og mennesker3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores omfattende vurdering forudsat en strengere statistisk analyse af omfanget af dynamikområde, som klart tilkendegivet, at omfanget af variation mellem individuelle prøver var yderst forskellige blandt de miRNAs testet. Selvom disse variationer kan henføres til deres små mængder i kropsvæsker, skal det bemærkes, at disse data afspejler ikke kun biologiske variationer, men også tekniske varianter. De fleste af de tekniske variation kan vurderes ved hjælp af Cq værdier af den eksterne kontrol (cel-miR-238), so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning har ikke modtaget nogen særlige tilskud fra finansielle organer i de offentlige, kommercielle eller ikke-for-profit sektorer.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
