Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR
Summary
Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.
Abstract
RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.
Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.
Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 102 copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.
Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.
Introduction
Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos1,2,3 . Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray4 y la secuencia de RNA a partir de plataformas5. En general, expresión de miRNA se mide en relación con una muestra de referencia utilizando el método de ΔCq6. Este enfoque es apropiado para la investigación de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, la cuantificación relativa de miRNAs en circulación ha limitado utilidad debido a sus pequeñas cantidades. Además, la variación técnica hace difícil comparar los resultados de diferentes estudios, ya que diferentes laboratorios personalizar los protocolos experimentales de RT-qPCR diferentemente, que conduce a incompatibles o incluso contradictorios resultados de diferentes estudios7.
En vista de las preocupaciones mencionadas, cuantificación absoluta podría ser más adecuada para la evaluación de las cantidades pequeñas de miRNAs en los fluidos corporales. El método de cuantificación absoluta utiliza una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de oligonucleótidos sintéticos de RNA que son idénticas en secuencia para el correspondiente destino miRNA8. La salud y el Instituto de ciencias ambientales (HESI) Comité técnico de genómica recientemente llevado a cabo estudios exhaustivos para comparar los resultados de medidas absolutas de miRNAs de plasma, a través de múltiples sitios de prueba. Los resultados mostraron que utilizando un protocolo estándar para la cuantificación absoluta de miRNAs produjo resultados comparables a través de la prueba de múltiples sitios9. El método de ensayo de RT-qPCR que se describe en el presente estudio es casi idéntico al protocolo estándar de HESI, que incluye análisis multiplexado de múltiples objetivos de miRNA y la amplificación para la detección de baja expresión de miRNAs.
En este estudio, recoge un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50) fue utilizado10. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la preparación de las muestras de plasma, extracción de miRNA y RT-qPCR, incluyendo la amplificación. Lo más importante, información técnica adicional sobre el protocolo se ha incluido, por lo que la cantidad de miRNAs de blanco en las muestras puede ser validada en combinación con un proceso bien calificado. En primer lugar, la curva estándar de cada miRNA se validó su rango de detección individual, antes de su cuantificación en muestras biológicas. En segundo lugar, la calidad de la metodología actual se evaluó exhaustivamente mediante valores de Cq de un control externo (cel-miR-238). Por lo tanto, esta plataforma proporciona datos más informativos y confiables para comparar resultados de diferentes estudios o laboratorios.
Los perfiles de 8 miRNAs se han incluido en este informe como resultados representativos por el método de ensayo descrito aquí. Estos miRNAs se han propuesto como biomarcadores potenciales de seguridad asociaron con lesión del tejido del hígado (miR-122 y miR-192), corazón (miR-1, miR-208a, 208b miR y miR-499a) y músculo esquelético (miR-133a y miR-206) en roedores y seres humanos3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestra evaluación completa proporciona un análisis estadístico más riguroso de la amplitud de la gama dinámica, que indica claramente que la magnitud de la variación entre muestras individuales fue muy diferente entre los miRNAs probado. Aunque estas variaciones pueden atribuirse a sus pequeñas cantidades en los fluidos corporales, debe señalarse que estos datos reflejan no sólo las variaciones biológicas, sino también variaciones técnicas. La mayoría de la variación de la técnica puede ser evaluada media…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de organismos de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
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