Абсолютная количественная оценка уровня микроРНК в плазме у обезьян Cynomolgus, используя количественные реального времени обратной транскрипции PCR
Summary
В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, использование количественных реального времени обратной транскрипции ПЦР с или без предварительного усиления. Этот протокол предоставляет лучшего понимания количества плазмы адаптивной и позволяет качественной оценки соответствующих данных из различных исследований или лаборатории.
Abstract
RT-ПЦР является одним из наиболее распространенных методов для оценки отдельных целевых адаптивной. Интерферирующим уровни обычно измеряется относительно эталонного образца. Этот подход является подходящим для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Тем не менее абсолютное количественной оценки, используя лучше статистический анализ является предпочтительным для всеобъемлющей оценки уровни выражения гена. Абсолютная количественной оценки до сих пор не в общем пользовании. В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, используя RT-ПЦР с или без предварительного усиления.
Фиксированный объем (200 мкл) ЭДТА-плазмы был подготовлен из крови, собранные из бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50). Общая РНК был извлечен с использованием коммерчески доступные системы. Интерферирующим плазмы были количественно методом на основе выборки RT-ПЦР анализа, которые содержит Мирна специфического праймера PCR реверса и зонд. Стандартные кривые для абсолютной количественной оценки были получены с помощью коммерчески доступных синтетические олигонуклеотиды РНК. Синтетический чел мир-238 был использован как внешнего управления для нормализации и качества оценки. Адаптивной, которые показали количественного определения цикла (Cq) значения выше 35 были предварительно усиливается до шаг ПЦР.
Среди 8 интерферирующим изучены мир-122, мир 133а и мир-192 были обнаруживаемыми без предварительного усиления, в то время как мир-1, мир-206 и мир 499a требуется предварительное усилители из-за их низкой выражение уровня. Мир 208А и мир 208В не было обнаружено даже после предварительного усиления. Пример обработки эффективность оценивалась по значениям Cq шипами чел мир-238. В этом методе анализа технические различия, по оценкам, будет меньше, чем 3 раза и нижний предел количественного определения (LLOQ) было 102 копии/мкл, для большинства обследованных адаптивной.
Этот протокол обеспечивает более точную оценку количества плазмы адаптивной и позволяет оценки качества соответствующих данных из различных исследований. Учитывая, что небольшое количество интерферирующим в жидкостях организма, предварительного усиления является полезным для улучшения обнаружения плохо выразил адаптивной.
Introduction
Все большее количество исследований изучает микроРНК (интерферирующим) в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза рака, или мониторинг и обнаружение других заболеваний в доклинических и клинических исследований,1,2,3 . Количественные реального времени обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР) является одним из наиболее распространенных методов, используемых для оценки отдельных целевых адаптивной, потому что этот метод является более чувствительным, чем microarray дна4 и РНК последовательности на основе платформы5. В общем Мирна выражение измеряется относительно эталонного образца, с помощью метода ΔCq6. Этот подход подходит для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Однако относительно количественной оценки циркулирующих интерферирующим ограниченную полезность из-за их малого количества. Кроме того технические изменения делает его трудно сравнивать результаты различных исследований, потому что различные лаборатории настроить RT-ПЦР экспериментальные протоколы по-разному, что приводит к несовместимым или даже противоречивые результаты от 7различные исследования.
С учетом проблем, упомянутых выше абсолютной количественной оценки может быть более подходящим для оценки небольших количествах интерферирующим в жидкостях организма. Метод количественной оценки абсолютной использует калибровочной кривой, созданный из известных концентрациях синтетические олигонуклеотиды РНК, которые идентичны в последовательности, соответствующей целевой Мирна8. Здравоохранения и экологических наук Институт (HESI) технический комитет по геномике недавно провели всеобъемлющие исследования для сравнения результатов абсолютных измерений интерферирующим плазмы, нескольких сайтах тест. Результаты показали, что использование стандартного протокола для абсолютной количественный интерферирующим показывают сопоставимые результаты через несколько сайтов тест9. RT-ПЦР анализа методом, описанным в настоящем исследовании практически идентичен HESI стандартный протокол, который включает мультиплексированных анализ нескольких целей Мирна и предварительного усиления помощи обнаружения низких выражение адаптивной.
В этом исследовании, фиксированного объема (200 мкл) ЭДТА-плазмы из крови собранные от бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50) был используется10. Следующий протокол описывает процедуру для подготовки проб плазмы, добыча Мирна и RT-ПЦР, включая предварительное усилители. Что еще более важно дополнительную техническую информацию о протоколе была включена, так что количество целевых интерферирующим в пробах может быть проверен в сочетании с высококвалифицированных процесса. Во-первых стандартной кривой каждого Мирна был апробирован для его обнаружения отдельных диапазона до его количественной оценки в биологических образцах. Во-вторых качество нынешней методологии было всесторонне оценивать с помощью ов значения внешнего контроля (чел мир-238). Таким образом эта платформа дает более информативным и достоверных данных для сравнения результатов различных исследований или лаборатории.
Как представитель результаты в настоящем докладе были включены профили 8 интерферирующим от метода анализа, описанный здесь. Эти интерферирующим были предложены как потенциальной безопасности биомаркеров, связанные с повреждения тканей печени (мир-122 и мир-192), сердца (мир-1, мир 208А, мир 208В и мир 499a) и скелетных мышц (мир 133а и мир-206) в люди и грызунов в3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нашей всеобъемлющей оценки представила более строгий статистический анализ степени динамического диапазона, который четко указал, что масштабы различия между отдельными пробами очень разные среди интерферирующим испытания. Хотя эти различия можно объяснить их небольших количества?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование не получил каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
