Een In Vivo lymfkliertest Ischiaszenuw Model van Perineural invasie

Summary

We beschrijven een in vivo lymfkliertest model van perineural invasie door het injecteren van syngeneic pancreatic kankercellen in de nervus ischiadicus. Het model zorgt voor de kwantificering van de omvang van de zenuw invasie, en ondersteunt onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen van perineural invasie.

Abstract

Kankercellen binnenvallen zenuwen door middel van een proces genoemd perineural invasie (PNI), in welke kanker cellen vermenigvuldigen en migreren in de communicatie van de zenuw. Dit soort invasie door allerlei soorten kanker wordt tentoongesteld, en zeer vaak in pancreatic kanker wordt gevonden. De microscopische grootte van zenuwvezels binnen muis alvleesklier maakt de studie van de PNI moeilijk in orthotopic lymfkliertest modellen. Hier beschrijven we een heterotopic in vivo -model van de PNI, waar wij syngeneic alvleesklierkanker cellijn Panc02-H7 in de nervus ischiadicus lymfkliertest injecteren. In dit model zijn de ischiadicus zenuwen van narcose muizen blootgesteld en ingespoten met kankercellen. De kankercellen binnenvallen in de zenuwen proximally richting het ruggenmerg vanuit het punt van de injectie. De binnengedrongen ischiadicus zenuwen zijn vervolgens uitgepakt en verwerkt met LGO voor bevroren segmenteren. H & E en immunofluorescentie kleuring van deze secties de kwantificering van zowel de mate van invasie en wijzigingen in eiwit expressie toestaan. Dit model kan worden toegepast op een verscheidenheid van studies over de PNI gegeven zijn veelzijdigheid. Met behulp van muizen met verschillende genetische modificaties en/of verschillende soorten kankercellen kan voor onderzoek van de cellulaire en moleculaire mechanismen van de PNI en voor kanker van de verschillende typen. Bovendien kunnen de effecten van therapeutische agenten op de zenuw invasie door behandeling toe te passen om deze muizen te worden bestudeerd.

Introduction

Zenuwen vormen een specifieke tumor communicatie dat kanker groei en migratie^{1,2,3 stimuleert}. Perineural invasie (PNI) is het proces via welke kanker cellen in en rond de zenuwen binnenvallen. Het kan worden beschouwd als een unieke route van metastase aangezien kanker invasie strekt zich uit van de bezienswaardigheden van oorsprong langs zenuwen. PNI komt voor in verschillende soorten kanker en alvleesklier-, prostaat, hoofd & nek, speeksel, cervicale, colorectal kanker met een incidentie variërend van 22% tot 100%^1,2. PNI wordt geassocieerd met pijn en correleert met slechte prognose en erger survival tarieven^1,2.

Het ontwikkelen van modellen van perineural invasie is essentieel verhelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van dit proces, en het testen van kandidaat-therapeutische agenten PNI afnemen. In vitro methoden van de studie van interacties tussen kanker en zenuwen omvatten de co cultuur van kankercellen met zenuw explantaten⁴, achterwortelganglia ganglion^5,6,7, of met bepaalde cellen van de zenuw cellen communicatie zoals Schwann⁷. In vivo benaderingen, echter meer fysiologisch relevant zijn, omvatten het gebruik van kanker Muismodellen waarin kanker heeft veroorzaakt of getransplanteerde en hebben het voordeel van de boekhouding voor de hele zenuw-communicatie. Modellen van de alvleesklier of prostaat kanker, PNI geweest gerapporteerde^8,9,10 in orthotopic en de incidentie van PNI kan worden vastgelegd, maar vanwege de kleine omvang van de zenuwen in deze organen, is het moeilijk om te zien de hele zenuw en daarom te kwantificeren van de omvang van de PNI. Het model die we hier beschrijven is een in vivo model van PNI in welke kanker cellen worden ingespoten in de nervus ischiadicus van muizen door middel van een eenvoudige chirurgische ingreep¹¹. De heterotopic transplantatie valt binnen in de zenuw naar het ruggenmerg. De lengte van de invasie van de zenuw van de site van injectie aan het ruggenmerg kan worden gemeten, evenals de omvang van de kanker binnen de zenuw. Nog belangrijker is, kan de binnengedrongen zenuw ook worden verzameld voor een verscheidenheid van tests met inbegrip van microscopische en moleculaire analyses. Een verscheidenheid van kankercellen kan worden getest, en de gastheer muizen die genetisch hebt gewijzigd of behandeld met specifieke verbindingen kunnen ook worden gebruikt. Deze krachtige test zorgt voor de kankercellen en de communicatie van de host worden gewijzigd voor onderzoek naar de mechanismen van de PNI.

Protocol

Alle procedures met dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1. bereiding van de kankercellen Oogst sub confluente Panc02-H7 cellen met 0,25% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Het verzamelen van de cellen in een centrifugebuis 15 mL.Opmerking: De cellen worden gekweekt in T-225 kolf, waarin ongeveer 12 x 106 cellen per erlenmeyer op 80% confluentie en 4 mL trypsin…

Representative Results

Deze methode beschrijft de chirurgische inplanting van pancreatic kankercellen in de lymfkliertest nervus ischiadicus om een model in vivo van kwantificeerbare zenuw invasie te maken. Figuur 1 illustreert de anatomische locatie van de nervus ischiadicus en de plaats van injectie. Figuur 2 toont de twee ischiadicus zenuwen van een naakt muis. Een PBS geïnjecteerd zenuw (links) kan worden vergeleken met een zenuw geïnje…

Discussion

In dit protocol beschrijven we een in vivo lymfkliertest model van perineural invasie die het mogelijk voor de kwantificering van de nervus ischiadicus invasie van pancreatic kankercellen maakt. Dit model maakt de studie van moleculaire mechanismen van zenuw invasie. Succesvolle experimenten met behulp van deze techniek vereist een zorgvuldige benadering van drie essentiële stappen in het proces: 1) de injectie van kankercellen (stappen 2.7, 2.8), 2) de winning van binnengevallen zenuwen (stap 3.4), en 3) verwe…

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1