В естественных условиях мышиных седалищного нерва модель рассасывании вторжения
Summary
Мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения путем введения сингенных поджелудочных клеток рака в седалищный нерв. Модель позволяет для количественной оценки степени нерва вторжения и поддерживает исследование молекулярных и клеточных механизмов рассасывании вторжения.
Abstract
Раковые клетки вторгнуться нервов через процесс называется рассасывании вторжения (Пни), в котором рака клетки размножаются и мигрируют в нерв микроокружения. Этот тип вторжения выставляется различных типов рака и очень часто встречается в рак поджелудочной железы. В ортотопическая мышиных моделях микроскопических размеров нервных волокон внутри мыши поджелудочной железы затрудняет изучение PNI. Здесь мы описываем модель heterotopic в vivo пни, где мы вводим сингенных поджелудочный рак клеток линии Panc02-H7 в мышиных седалищного нерва. В этой модели седалищного нервов наркотизированных мышей подвергаются и вводят с раковых клеток. Раковые клетки вторгнуться в нервы проксимально к спинного мозга от точки инъекции. Вторглись седалищного нервов затем извлекаются и обрабатываются с октября для замороженных секционирование. H & E и иммунофлюоресценции пятнать этих разделов позволяют количественной оценки степени вторжения и изменения экспрессии белков. Эта модель может применяться для различных исследований на пни, учитывая его универсальность. С помощью мыши с различных генетических модификаций и/или различных типов раковых клеток позволяет для расследования молекулярных и клеточных механизмов пни и рака различных типов. Кроме того воздействие терапевтических агентов на нерв вторжения могут быть изучены путем применения лечения этих мышей.
Introduction
Нервы образуют конкретную опухоль микроокружения, который стимулирует рак роста и миграции1,2,3. Рассасывании вторжения (Пни) — это процесс, через который раковых клеток вторгнуться в и вокруг нервы. Он может быть рассматриваться как уникальный маршрут метастазов рака вторжения простирается от места происхождения по нервам. PNI встречается в нескольких типов рака, включая поджелудочной железы, предстательной железы, головы и шеи, слюнных, шейки матки и колоректального рака, заболеваемость, начиная от 22% до1,100%2. PNI связано с болью и коррелирует с плохим прогнозом и хуже выживание ставки1,2.
Разработка моделей рассасывании вторжения имеет важное значение для выяснения молекулярных и клеточных механизмов этого процесса и кандидат терапевтических агентов тестирования для уменьшения PNI. В vitro методы изучения взаимодействия между раком и нервы включают в себя совместное культура раковых клеток с нерва эксплантов4, Спинной корень ганглиев5,6,7или с конкретных ячеек от нерва микроокружения например Шванновские клетки7. В естественных условиях подходы, однако, являются более физиологически соответствующие, включают использование моделей мыши рака в которых рак индуцированных или пересадить и имеют преимущество приходится всего нерва микроокружения. В ортотопическая модели рака поджелудочной железы и простаты, PNI был сообщил8,9,10 и заболеваемости PNI могут быть записаны, но из-за небольшого размера нервы в этих органах, трудно увидеть весь нерв и поэтому для количественной оценки степени PNI. Модель, которую мы опишем здесь является модель в vivo пни, в котором рака клетки вводят в седалищный нерв мышей через простой хирургическая процедура11. Heterotopic трансплантация вторгается в сторону спинного нерва. Длина нерва вторжения с сайта инъекции для спинного мозга могут быть измерены, а также объем рака в течение нерва. Важно отметить, что вторглись нерва также могут быть собраны для различных анализов, включая микроскопические и молекулярного анализа. Целый ряд раковых клеток может быть проверена, и принимающей мышей, которые были генетически изменены или с конкретных соединений могут быть использованы также. Этот мощный assay раковые клетки и микроокружения хост позволяет быть модифицированы для расследования механизмы PNI.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения, который позволяет для количественной оценки седалищного нерва вторжения поджелудочных клеток рака. Эта модель позволяет изучение молекулярных механизмов нерва вторжения. Успешные эксперименты с использо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают технические услуги, предоставляемые Фондом молекулярных цитологии и животных фонд Мемориал Слоун Kettering Рак центр. Эта работа была поддержана NIH грантов CA157686 (РЖ Wong) и CA008748 Р30 (Мемориал Слоун Kettering Рак центр поддержки Грант).
Materials
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
- Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
- Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
- Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
- Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
- Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).
