Summary

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

Published: December 22, 2017
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Summary

人間の皮膚は外部環境に対する防御の最初の行として機能します。大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を分離する手法を提案します。これらの孤立したケラチノ サイトは、多数の実験のセットアップに便利、皮膚の生物学の in vitroの分子機構を研究するための非常に適してモデル

Abstract

ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界に機械的な障壁を維持する表皮の構造的な整合性を提供することです。加えて、ケラチノ サイトは、高速、非特異的に抗原刺激に応答する生得の免疫組織の部分であることによって開始、保守、および表皮の免疫応答の調節に重要な役割を再生します。ここで、成人の皮膚から人間ケラチノ サイト主の隔離のためのプロトコルを記述し、これらの細胞はカルシウム誘発性分化、分化マーカー involucrin の発現の増加によって測定されるように応答を示します。さらに、分離のケラチノ サイトが p38 MAPK 経路の活性化による細胞内シグナル伝達経路の IL 1 β による活性化に敏感であることを示します。一緒に取られて、分離、成人の皮膚からプライマリ ヒト角化培養するための方法について述べる。優勢な細胞型表皮ケラチノ サイトであるために、このメソッドは皮膚の生物学体外の分子メカニズムの研究に有用です。

Introduction

皮膚は人体の最大の臓器であり、外部環境に対する保護バリアとして機能します。皮膚は 2 つの主要な層で構成される: 真皮と表皮が皮膚の最外層を構成する表皮。表皮の最も豊富なセル型はケラチノ サイト細胞質量1,2の 95% 以上を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の分化の各段階で維持され、分化3の特定の段階に対応する基底、棘、粒状、角質層に分類されます。ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界にそのままバリアを作り出す表皮の構造的な整合性を提供することです。

ケラチノ サイトも皮膚の病原体に対する防御の最初の行を表す、したがって自然免疫応答4,5で重要な役割を果たします。ケラチノ サイトの外部からの刺激への暴露は、サイトカイン、ケモカイン、および抗菌ペプチドを含む様々 な炎症性メディエーターの数の生産をその後、細胞内のシグナル伝達経路の活性化につながります。これら表皮細胞由来のタンパク質は募集し、特定の T 細胞67好中球、樹状細胞などの免疫細胞を活性化して炎症反応に参加します。したがって、ケラチノ サイトは、多数の生物学的プロセスに重要な役割を果たす、ので、ここで示した手法の背後にある理論的根拠は皮膚生物学を勉強するための in vitroモデルを生成します。新生児包皮から得られるプライマリ ケラチノ サイト培養皮膚生物学8,9の研究に使われます。ただし、ここで説明する手法に男女両方からケラチノ サイトは、細胞の高い生物学的多様性の結果取得されます。

ここでは、メンテナンスを含むとケラチノ サイトの凍結分離と大人の皮膚からプライマリ ヒト角化世代の詳細なプロトコルを提案します。このメソッドの全体的な目標は、 in vitro皮膚の生物学を研究するモデルとして使用することができますプライマリの人間ケラチノ サイトを生成することです。

Protocol

プラスチック製の手術健康な成人ボランティアの皮膚のサンプルのコレクションには、ホスト機関の倫理委員会の承認が必要です。このプロトコルは、地域倫理委員会の地域中央ユラン地域、デンマーク (M-20110027) によって承認されました。ここで説明したメソッドが Maciaqらによって同様の研究から派生します。10劉と Karasek11。 1…

Representative Results

カルシウム誘発性分化ヒト角は、カルシウム14,,1516と分化を受けます。プライマリ ヒト角が分離・培養上のプロトコルで説明されているようです。約 50-60% 合流がカルシウム (1.2 mM) と細胞が刺激され、車両とセルの写真は、0、1、および 2 の日に撮影されました。カルシウム刺激時に観察されるケラチノ サ…

Discussion

ここでは、大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を簡単に分離する方法、およびそれらを体外培養する方法について述べる。このモデルは、表皮の細胞生物学の調査のための広範なアプリケーションを持つことができます、皮膚病の研究に興味を持って研究に便利することができます。

ここで説明したプロトコルの利点のいくつかは新生児の男性の割礼を受けて?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者が彼らのテクニカル サポートのアネット ・ ディスティニー ラスムッセンとクリスティン ・ メラーに深くお礼申し上げます

Materials

KSFM ThermoFisher Scientific 17005-034 Cell culture medium
KSFM supplements ThermoFisher Scientific 37000-015 Supplements for KSFM
DPBS ThermoFisher Scientific 14190-144 DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Dimethyl sulfoxid
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15710-049 Cell culture medium additive
Sterilization filter Sartorius 16534 Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin Sigma-Aldrich T7409 Used to trypsinize cells
Glucose Sigma-Aldrich G7528
RPMI-1640 ThermoFisher Scientific 61870-010
FBS ThermoFisher Scientific 16000044 Used to inactivate trypsin
Forceps Forceps from any company can be used
Scissors Scissors from any company can be used
Scalpel Swann Morton 0501 Scalpels from any company can be used
70% ethanol
Gauze pads NOBAMED 875420 Gauze pads from any provider can be used
Foot planer Credo Solingen 1510 Foot planer from any provider can be used
Petri dishes TPP 93100 Petri dishes from any provider can be used
Metal filter In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks NUNC 156499
150 cm2 culture flasks TTP 90151
0.05% Trypsin-EDTA solution ThermoFisher Scientific 25300-062 Used to trypsinize cells when passaging

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Cite This Article
Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (130), e56863, doi:10.3791/56863 (2017).

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