Summary

Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи

Published: December 22, 2017
doi:

Summary

Человеческая кожа выступает в качестве первой линии обороны против внешней среды. Мы представляем метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Эти изолированные кератиноцитов полезны в многочисленных экспериментальных установок и являются весьма подходящую модель для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.

Abstract

Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым сохраняя механический барьер с внешним миром. Кроме того кератиноциты играют важную роль в инициации, техническое обслуживание и регулирование эпидермальный иммунных реакций, будучи частью иммунной системы реагировать антигенной стимулы быстрый, неспецифические способом. Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи и продемонстрировать, что эти клетки реагируют на кальций индуцированной терминала дифференциации, определяемой выражением рост дифференциации маркер involucrin. Кроме того мы показываем, что изолированные кератиноцитов реагировать ИЛ 1β-индуцированной активации внутриклеточных сигнальных путей, как измеряется активации p38 MAPK путь. Взятые вместе, мы описываем метод для изоляции и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи. Потому что кератиноцитов тип преобладает ячейки в эпидермисе, этот метод является полезным для изучения молекулярных механизмов в биологии кожного в витро.

Introduction

Кожа является большой орган человеческого тела и служит защитным барьером против внешней среды. Кожа состоит из двух основных слоев: дермы и эпидермиса, где эпидермис представляет внешний слой кожи. Наиболее распространённый тип ячейки в эпидермис является кератиноцитов, состоящий из более чем 95% массы1,клетки2. Кератиноциты ведутся на различных стадиях дифференцировки в эпидермисе и организованы в базальной, остистых, гранулированных и ороговевшем слои, которые соответствуют конкретные этапы дифференцировки3. Основная функция кератиноцитов является предоставить структурной целостности эпидермиса, тем самым производить нетронутыми барьер с внешним миром.

Кератиноциты, также представляют собой первую линию обороны против патогенов в коже и поэтому играют важную роль в врожденный иммунный ответ4,5. Воздействие кератиноцитов на внешние раздражители приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей и впоследствии, производство целого ряда различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, chemokines и противомикробные пептиды. Эти белки кератиноцитов производные участвуют в воспалительной реакции путем набора и активация иммунных клеток, таких как дендритные клетки, нейтрофилов и конкретных T клетки6,7. Таким образом потому что кератиноцитов играют решающую роль в многочисленных биологических процессах, обоснование техника, представленная здесь заключается в том, сформировать в vitro модель для изучения биологии кожи. Первичный кератиноцитов культур, полученных от крайней плоти новорожденных часто используются для изучения кожи биологии8,9. Однако с техникой, описанных здесь, кератиноциты от обоих полов получаются, что приводит к более высокой биологического разнообразия клеток.

Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции и генерация первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи, включая техническое обслуживание и замораживания кератиноцитов. Общая цель этого метода заключается в генерации первичных человеческие кератиноциты, который может использоваться в качестве модели для изучения кожный биологии в пробирке.

Protocol

Коллекция образцов кожи от здоровых взрослых добровольцев, переживает пластической хирургии требует одобрения от этического Комитета в принимающих учреждениях. Этот протокол был одобрен региональной этического Комитета региона Midtjylland, Дания (M-20110027). Метод, описанный здесь является п?…

Representative Results

Кальций индуцированной терминала дифференциацияЧеловеческие кератиноциты проходят терминала дифференциация по обращению с кальция14,,1516. Основная человеческие кератиноциты были изолированы и культивировали как описано ?…

Discussion

Здесь мы описываем, как легко изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожи и как их культуры в пробирке. Эта модель может иметь широкое применение для исследования биологии эпидермальных клеток и может быть полезным для исследователей, заинтересованных в изу?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Автор хотела бы поблагодарить за их техническую поддержку Annette Blak Расмуссен и Кристин Мюллер

Materials

KSFM ThermoFisher Scientific 17005-034 Cell culture medium
KSFM supplements ThermoFisher Scientific 37000-015 Supplements for KSFM
DPBS ThermoFisher Scientific 14190-144 DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Dimethyl sulfoxid
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15710-049 Cell culture medium additive
Sterilization filter Sartorius 16534 Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin Sigma-Aldrich T7409 Used to trypsinize cells
Glucose Sigma-Aldrich G7528
RPMI-1640 ThermoFisher Scientific 61870-010
FBS ThermoFisher Scientific 16000044 Used to inactivate trypsin
Forceps Forceps from any company can be used
Scissors Scissors from any company can be used
Scalpel Swann Morton 0501 Scalpels from any company can be used
70% ethanol
Gauze pads NOBAMED 875420 Gauze pads from any provider can be used
Foot planer Credo Solingen 1510 Foot planer from any provider can be used
Petri dishes TPP 93100 Petri dishes from any provider can be used
Metal filter In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks NUNC 156499
150 cm2 culture flasks TTP 90151
0.05% Trypsin-EDTA solution ThermoFisher Scientific 25300-062 Used to trypsinize cells when passaging

References

  1. Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
  2. Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
  5. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
  6. Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
  7. Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
  8. Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
  9. Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
  10. Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
  11. Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
  12. Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
  13. Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
  14. Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
  15. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
  16. Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
  17. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
  18. Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
  19. van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
  20. Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (130), e56863, doi:10.3791/56863 (2017).

View Video