Generation och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud
Summary
Den mänskliga huden fungerar som en första försvarslinje mot den yttre miljön. Vi presenterar en metod för att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud. Dessa isolerade keratinocyter är användbar i många experimentella uppställningar, och är en mycket lämplig modell för att studera molekylära mekanismer vid kutan biologi in vitro-.
Abstract
Den huvudsakliga funktionen av keratinocyter är att ge den strukturella integriteten av epidermis, därigenom bibehålla en mekanisk barriär mot omvärlden. Dessutom spelar keratinocyter en viktig roll i den inledande, underhåll och reglering av epidermal immunsvaret genom att vara en del av det medfödda immunsystemet svarar på antigena stimuli i en snabb, ospecifik sätt. Här beskriver vi ett protokoll för isolering av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud, och visa att dessa celler svarar på kalcium-inducerad terminal differentiering, mätt med ett ökat uttryck av den differentiering markör involucrin. Vi visar dessutom att de isolerade keratinocyterna är lyhörda för IL-1β-inducerad aktivering av intracellulära signalvägar mätt med aktivering av den p38 MAPK-signalvägen. Sammantaget beskriver vi en metod för isolering och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud. Eftersom keratinocyterna är den dominerande Celltypen i epidermis, är denna metod användbar för att studera molekylära mekanismer vid kutan biologi in vitro.
Introduction
Huden är det största orgeln i människokroppen och fungerar som en skyddande barriär mot den yttre miljön. Huden består av två huvudsakliga lager: dermis och epidermis, där överhuden utgör det yttersta lagret av huden. Den vanligast förekommande Celltypen i epidermis är den keratinocyter som omfattar mer än 95% av cell mass1,2. Keratinocyterna upprätthålls i olika skeden av differentiering i överhuden och är organiserade i basal, ryggkotornas, granulat och cornified lager som motsvarar specifika stadier av differentiering3. Keratinocyter primära funktion är att ge den strukturella integriteten av epidermis, vilket framkallar en intakt barriär till omvärlden.
Keratinocyterna också utgör den första försvarslinjen mot patogener i huden, och därför spela en viktig roll i det medfödda immunförsvar4,5. Exponering av keratinocyter för yttre stimuli leder till aktivering av intracellulära signalvägar och därefter, produktion av ett antal olika inflammatoriska mediatorer inklusive cytokiner, chemokiner och antimikrobiella peptider. Dessa keratinocyter framställda proteiner deltar i den inflammatoriska reaktionen genom att rekrytera och aktivera immunceller som dendritiska celler, neutrofiler och specifika T celler6,7. Således, eftersom keratinocyter spelar en avgörande roll i många biologiska processer, logiken bakom den teknik som presenteras här var att generera ett in vitro- modell för att studera hudbiologi. Primära keratinocyter kulturer erhållits från neonatal förhud används ofta för att studera hud biologi8,9. Dock med den teknik som beskrivs här, erhålls keratinocyter från båda könen vilket resulterar i en högre biologisk mångfald av cellerna.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för isolering och generering av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud, inklusive underhåll och frysning av keratinocyter. Det övergripande målet med denna metod är att generera primära mänskliga keratinocyter som kan användas som en modell för att studera kutan biologi in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi hur du enkelt isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud och hur du kultur dem i vitro. Denna modell kan ha en bred tillämpning för utredning av epidermal cellbiologi, och kan vara användbar för forskare som är intresserade av att studera kutan sjukdomar.
Några av fördelarna med av protokollet som beskrivs här är att i motsats till keratinocyter isolerade från neonatal förhud erhållits från nyfödda män som genomgår omskärelse, primära…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill tacka Annette Blak Rasmussen och Kristine Moeller för deras tekniska support
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
