Aquí se demuestra un detallado proceso de análisis de cuantitativo dot blot (QDB) determinando el contenido absoluto de una proteína específica, capsulando la proteína actina, gelsolina-como (CAPG), en tres tejidos de ratón diferente. Demostrar un alto rendimiento, técnica de immunoblot conveniente y cuantitativa para la validación de biomarcadores a nivel celular y tejido.
Falta un conveniente, método de immunoblot cuantitativa, de alto rendimiento para la determinación absoluta del contenido de una proteína específica a nivel celular y tejido dificulta significativamente el progreso en la investigación proteómica. Resultados derivados de las técnicas de inmunoblot actualmente disponibles son también relativos, evitando esfuerzos para combinar estudios independientes con un análisis a gran escala de las muestras de proteína. En este estudio, demostramos el proceso de análisis de cuantitativo dot blot (QDB) para lograr la cuantificación absoluta en un formato de alto rendimiento. Usando un estándar de proteína disponible en el mercado, somos capaces de determinar el contenido absoluto de capsular proteína actina, gelsolina-como (CAPG) en muestras de proteínas preparados a partir de tres tejidos de ratón diferente (riñón, bazo y próstata) junto con una detallada explicación de los detalles experimentales. Proponemos el análisis QDB como un método de inmunoblot conveniente, cuantitativo de alta rendimiento de cuantificación absoluta de proteínas individuales en el nivel celular y tejido. Este método ayudará sustancialmente a validación de biomarcadores y la verificación de la vía en varias áreas de investigación biológica y biomédica.
Junto con los avances emocionantes en la investigación genómica en los últimos años, campo de la investigación biomédica testigos también el importante avance en la investigación proteómica. Con el aumento de acumulación de datos biológicos en tanto genómicos y proteómicos, usando herramientas bioinformáticas para analizar estos datos se ha convertido en el foco de la investigación biomédica en el futuro puedan percibir. En consecuencia, el éxito de la investigación de bioinformatical plantea la demanda de más y mejor calidad de los datos de la comunidad de investigación biológica y biomédica, una tarea sólo puede lograrse a través de adelanto de la técnica en genómica y proteómica.
Espectrometría de masas (MS) y el análisis de immunoblot son actualmente dos técnicas vigentes de análisis de la proteína. MS ha dominado la investigación proteómica en los últimos años para permitir análisis de miles de proteínas individuales al mismo tiempo. Las técnicas basadas en immunoblot, incluyendo western blot y dot blot, por el contrario, han también desempeñado un papel importante en la investigación de proteína incluso desde su invención1,2,3,4, 5. Enzima ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo5,6,7 y fase inversa proteína microarrays (RPPM)8,9 se puede considerar el formato de alto rendimiento de immunoblot Análisis. Sin embargo, todos estos métodos de inmunoensayo, excepto ELISA, medir el nivel de expresión relativa de una proteína específica. La naturaleza relativa de estos métodos se convertirá en un verdadero problema para los estudios de población, como el análisis debe hacerse al mismo tiempo, evitando cualquier esfuerzo para aumentar el tamaño de la piscina a través de múltiples análisis. Además, los resultados derivados de estos estudios sólo son semi-cuantitativo, complicando así los esfuerzos de la Bioinformática en el análisis de datos. Mientras tanto, aunque ELISA está bien adaptado para el análisis absoluto de alto rendimiento de muestras de proteínas, esta técnica parece que retos en entornos complejos como las células o los tejidos debido a su baja capacidad y multiplexación10.
Hemos desarrollado un método de inmunoblot adecuado para estudios de población con las características de ser conveniente, alto rendimiento, cuantitativo y conveniente para la determinación absoluta del contenido de proteínas y nombre de esta técnica cuantitativa punto la mancha blanca /negra Análisis (QDB)11. En este estudio, presentamos un protocolo detallado para el análisis QDB y demuestran el método de determinación del contenido de proteína absoluta de una proteína específica, CAPG, en tres tejidos de ratón diferente incluyendo próstata, riñón y bazo. Creemos que este protocolo detallado bien ilustra la factibilidad y conveniencia de este método y proporcionar orientación sobre cómo evitar las trampas posibles en la práctica de este método.
Entre todas las actuales inmunoensayo disponibles técnicas de análisis de la proteína excepto ELISA, QDB análisis es el único método para alcanzar el contenido absoluto de una proteína específica a nivel celular y tejido en un formato de alto rendimiento. Aunque con el estándar marcado con el isótopo estable, espectrometría de masas es capaz de lograr la cuantificación absoluta de algunas proteínas, este método todavía no está diseñado para alto rendimiento. En este estudio, hemos demostrado el proceso de análisis QDB para lograr la absoluta determinación del CAPG nivel de proteína en tejidos de ratón incluyendo la próstata, riñón y bazo. Niveles CAPG se encontraron entre 200 y 360 pg/g en los tejidos de riñón de ratón, 460 a 650 pg/g en bazos de ratón y 330 a 390 pg/g en los tejidos de próstata del ratón.
Comparado con el ELISA, QDB análisis requiere esfuerzos mínimos a desarrollar en un laboratorio normal. En primer lugar, la placa QDB está basado en una membrana de nitrocelulosa para eliminar el paso de la capa de ELISA. En segundo lugar, el análisis QDB sólo requiere uno en vez de dos anticuerpos específicos en un sandwich ELISA. En tercer lugar, la alta capacidad de la membrana de nitrocelulosa en comparación con la superficie de la placa de ELISA también permite que la membrana soportar los pasos de lavado riguroso suele utilizados en el análisis de immunoblot para reducir la interferencia de fondo. Esta característica es muy útil para analizar la complicada lisados de células y tejidos. Por el contrario, debido a la capacidad relativamente baja de placas de ELISA, la reducción del fondo al analizar complicadas Lisados celulares y tejido se convierte en un verdadero desafío en el proceso de desarrollo.
Análisis QDB pueden ser adoptada fácilmente en cualquier laboratorio con el acceso de un anticuerpo específico. Sin embargo, es importante mencionar que la especificidad del anticuerpo es un término relativo, limitado por factores como la especie, tipos de tejidos y tipos celulares. Como se muestra en la figura 1A, CAPG anticuerpo es específico al análisis de lisado de próstata, el bazo y el riñón de ratón y todavía se convierte en no específicos al analizar el hígado del ratón. De hecho, habitualmente encontramos un anticuerpo que específico para el tipo de un tejido, pero no siempre específico a otro tipo de tejido de la misma especie. Así, mancha blanca /negra occidental previo análisis es necesario para asegurar la especificidad de los análisis QDB. De hecho, la relativa especificidad del anticuerpo puede ser la causa de resultados falsos a menudo asociados con el análisis de ELISA, que no importa cuánto esfuerzo la empresa puede haber pasado para asegurar la especificidad de la prueba, no escape el posible tipos de muestras los usuarios pueden optar por analizar utilizando sus productos de ELISA.
Como con todos los inmunoensayos, un problema potencial con el método de análisis QDB es la falta de consistencia de la calidad de los anticuerpos comerciales. Aunque la calidad aparente de un anticuerpo de la misma empresa (mismo catálogo número, etc.) se utiliza, puede haber grandes diferencias de una compra a otro debido a la variabilidad de lote a lote. Por lo tanto, salvo que haya alcanzado la plena confianza en la calidad de los anticuerpos disponibles, volver a caracterizar el anticuerpo sobre cada compra es importante.
En Resumen, le ofrecemos aquí un protocolo detallado y un ejemplo al utilizar el método de análisis QDB para lograr absoluta determinación cuantitativa de una proteína específica en el nivel de tejido. Nos muestran que el método de análisis QDB es una herramienta conveniente para cualquiera que esté interesado en alto rendimiento, el análisis de immunoblot cuantitativa. Su capacidad para lograr la absoluta determinación del contenido de una proteína específica a nivel celular y tejido también distinguir esta técnica de inmunoblot tradicionales técnicas. Esta característica permite la combinación y la comparación de los resultados de múltiples análisis, un paso necesario especialmente en estudios más amplios de la población y la realización de estudios de la Asociación pertinente en el nivel de proteína en un futuro cercano.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por Taishan eruditos construcción ingeniería (G.T.), el Shandong excelente Young Scientist Award (ZR2016JL026 a G. T.), nacional Ciencias naturales Fundación de China (31771284, 3167070448 y 81641108), Shandong provincial natural Fundación de la ciencia (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provincial ciencia y tecnología Plan (J14LE01 y J15LK03), plan(2015ZH083) de ciencia y tecnología de Yantai y Binzhou médica Universidad científica fondos de investigación (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), el Consejo de investigación sueco otorga 621-2011-4423 y 2015-4870. Este trabajo también es patrocinado por “Yantai doble cien talentos Plan” y “Yantai Hi-Tech zona azul talento Plan del océano”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |