ここゲルゾリンのようなの (の CAPG)、3 つの異なるマウス組織におけるアクチン タンパク質をキャッピング標的蛋白質の絶対的なコンテンツを決定することにより定量点のしみの分析 (おっ) の詳細なプロセスを示します。高スループット、定量的、便利 immunoblot 細胞およびティッシュのレベルでのバイオ マーカーの検証法を紹介しています。
便利な欠けている、細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の量の絶対測定の定量的、高スループット イムノブロット法の大幅プロテオーム研究の進行を妨げます。イムノブロットの現在利用可能な手法から得られた結果は、相対的な蛋白質のサンプルの大規模解析と独立した研究を結合するすべての努力を防ぐことも。本研究では、定量的ドットのしみの分析 (おっ) 高スループット形式で絶対的な数量を達成するためにプロセスを示します。市販蛋白質の標準を使用して、我々 はアクチン蛋白質、ゲルゾリンのような (CAPG) とともに詳細な 3 つの異なるマウス臓器 (腎臓、脾臓、前立腺) から調製したタンパク質サンプルをキャッピングの絶対的なコンテンツを決定することができます。実験の詳細の説明。細胞およびティッシュのレベルでの個々 のタンパク質の絶対定量の便利な量的な高スループット イムノブロット法としておっ解析を提案します。このメソッドは、バイオ マーカーの検証および生物医学研究の様々 な分野で経路確認を大幅に支援します。
と一緒に近年、ゲノム研究の刺激的な進歩と生物医学研究フィールドも目撃するプロテオーム研究の大幅な進歩。両方のゲノムの生物学的データの蓄積を増加およびプロテオーム レベル、将来的に知覚できる生物医学研究の焦点となっている bioinformatic ツールを使用してこれらのデータを分析します。その結果、基づく研究の成功は、生物学的および生物医学の研究コミュニティからのデータより良い品質のための需要を発生させます、タスクはゲノムで技術進歩によってのみ達成できるとプロテオーム レベル。
質量分析法 (MS) とイムノブロット解析、タンパク質解析の 2 つの支配的な技術は現在。MS は、近年たくさんの個々 の蛋白質の解析を同時に有効にするのに、プロテオーム研究を支配しています。西部のしみやドットのしみなど、イムノブロット ベースの手法、他の一方で、また役割を果たしている重要なタンパク質の研究における発明1,2,3,4、以降も 5。酵素リンク免疫測定法 (ELISA)5,6,7とイムノブロットの高スループット形式と考えられる逆相蛋白質マイクロ アレイ (RPPM)8,9解析。ただし、ELISA を除いて、すべてのこれらの免疫測定法は、特定のタンパク質の相対発現レベルを測定します。これらのメソッドの相対的な性質は、分析、同時に行う必要があります複数の解析を通してプール サイズを大きく任意の努力を防止すると人口研究の実際の問題になります。さらに、これらの研究から派生した結果は、定量的データ解析におけるバイオインフォマティクス努力をこのように複雑。一方、ELISA はよく蛋白質のサンプルの高スループット絶対解析に適していますが、この手法は、低結合容量と10を多重化のための細胞や組織などの複雑な環境の課題に対応するようです。
便利で、高スループット、定量的、かつ、タンパク質含有量の絶対測定に適したであることの特徴と人口研究に適したイムノブロット法を開発し、この手法の定量的ドットしみを名前付き分析 (おっ)11。本研究でっ分析のための詳しいプロトコルと腎臓、脾臓、前立腺など 3 つの別のマウス組織における特定の蛋白質、CAPG、絶対タンパク質含有量を決定することによって、メソッドを示します。我々 はこの詳細なプロトコルは可能性とこのメソッドの利便性も示していますだと思うし、このメソッドの練習の潜在的な落とし穴を回避する方法に関するガイダンスを提供します。
技術の中ですべての現在利用可能な免疫測定法 ELISA 以外のタンパク質解析のおっ分析は高スループット形式の細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の絶対的なコンテンツを実現する唯一の方法です。安定同位体標識標準質量は、いくつかのタンパク質の絶対定量を達成することが、このメソッドは、まだ高いスループット ・ パフォーマンスの設計されていません。本研究では、腎臓、脾臓、前立腺などマウス組織における CAPG 蛋白質レベルの絶対定量を達成するためにおっ分析のプロセスを示した。CAPG レベルは、360 に 200 pg/g マウス腎組織で、460 に 650 pg/g マウスの脾臓では 330 に 390 pg/g マウス前立腺組織内のことがわかった。
おっ解析 elisa 法と比較して、通常のラボで開発する最低限の努力が必要です。まず、おっプレートはに基づいて ELISA の塗装手順を除去するために硝酸セルロースの膜です。第二に、のみおっ分析のサンドイッチ elisa 法の 2 つの特定の抗体の代わりに 1 つ必要があります。第三に、ELISA プレート表面に比べて硝酸セルロースの膜の高い結合容量通常バック グラウンド干渉を低減するイムノブロット解析で使用される厳しい洗浄手順に耐えるように膜ができます。この機能は、非常に複雑な lysates セルおよびティッシュから準備の分析に便利です。対照的に、ELISA プレートの比較的低結合容量、ため複雑な細胞およびティッシュの lysates を分析する際のバック グラウンドの低減の発達過程で本当の課題になります。
おっ分析は特定の抗体のアクセス権を持つ任意のラボで簡単に適用できます。ただし、抗体の特異性は種、組織細胞の種類などの要因によって制限、相対的な用語であることを言及することが重要です。図 1Aのように、CAPG 抗体マウス腎臓、脾臓、前立腺、ライセートを分析する際は、固有なりまだ非特異的マウス肝臓を解析するとき。実際には、我々 は日常的が 1 つの組織の種類、常に固有ではないその他の組織型に同じ種から 1 つの抗体を発見します。したがって、前の西部のしみの分析はおっ解析の特異性を確保するため必要です。実際には、製造会社が費やしているどれだけの努力に関係なく、アッセイの特異性を確保するため彼らできない排気すべての可能な抗体の相対的な特異性 ELISA 解析に多くの場合関連付けられている偽の結果の原因である可能性があります。サンプル ユーザーの種類は、ELISA 製品の使用を分析できます。
すべてイムノアッセイと同様おっ分析方法の潜在的な問題は市販抗体の品質の一貫性の欠如です。たとえ同じ抗体の見かけの品質会社 (同じカタログ番号等) が使用されて、別のバッチ間の変動に起因する 1 つの購入から大きな違いがある可能性があります。したがって、使用可能な抗体の品質に絶対の自信を達成しない限り、再すべての購入時に抗体の特性が重要です。
要約すると、ここで詳細なプロトコル ・実施例おっ分析メソッドを使用して組織レベルで特定のタンパク質の絶対定量法を達成するためにします。おっ解析法が高スループット、定量的イムノブロット解析に興味がある人のための便利なツールであることを示します。細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の量の絶対測定を達成するためにその能力はまた伝統的なイムノブロット法からこの手法を区別します。この機能は、複数の解析、大きい人口研究に特に必要なステップおよび蛋白質レベルで関連する学会の実現は近い将来の結果の比較と組み合わせにできます。
The authors have nothing to disclose.
この作品はサポートで泰山学者建設エンジニア リング (g. t.)、「山東省優秀な若手奨励賞 (g. t. に ZR2016JL026)、国家自然科学基金中国の (31771284、3167070448、および 81641108)、山東地方の自然科学技術振興財団 (ZR2016JL026、2017GSF18103)、山東省科学技術計画 (J14LE01 と J15LK03)、煙台科学技術 plan(2015ZH083)、賓県医療大学科学研究費 (BY2013KYQD17、BY2013KYQD18)スウェーデンの研究評議会は、621-2011-4423 と 2015 4870 を付与します。 この作品は「烟台ダブル百才能プラン」と「烟台ハイテク ゾーン青い海の才能計画」もスポンサーです。
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |