Aqui vamos demonstrar um processo detalhado de análise de borrão ponto quantitativa (QDB) determinando o conteúdo absoluto de uma proteína alvo, tampando a proteína actina, como gelsolin (CAPG), em três tecidos diferentes do rato. Vamos demonstrar um alto throughput, conveniente, quantitativos immunoblot técnica para validação de biomarcador no nível celular e tecido.
Falta um conveniente, método de immunoblot quantitativa, alta taxa de transferência para absoluta determinação do conteúdo de uma proteína específica a nível celular e tecido significativamente dificulta o progresso na pesquisa de proteômica. Resultados derivados de immunoblot atualmente disponíveis técnicas também são relativos, impedindo quaisquer esforços para combinar estudos independentes com uma análise em larga escala de amostras da proteína. Neste estudo, demonstramos o processo de análise de borrão ponto quantitativa (QDB) para alcançar a quantificação absoluta em um formato de alta taxa de transferência. Usando um padrão de proteína disponível comercialmente, somos capazes de determinar o conteúdo absoluto de nivelamento da proteína actina, como gelsolin (CAPG) em amostras da proteína preparados a partir de três tecidos de mouse diferente (rins, baço e próstata) juntamente com um detalhado explicação dos detalhes experimentais. Propomos a análise QDB como um método de immunoblot conveniente, quantitativos, alta taxa de transferência de quantificação absoluta de proteínas individuais a nível celular e tecido. Este método irá ajuda substancialmente biomarcador validação e verificação de percurso em várias áreas de pesquisa biológica e biomédica.
Ao lado com os emocionantes avanços em pesquisa genômica nos anos recentes, campo de investigação biomédica também testemunhas o avanço significativo na pesquisa proteômica. Com o aumento da acumulação de dados biológicos em ambos genômica e proteômica níveis, usando ferramentas de bioinformatic para analisar esses dados tornou-se o foco da investigação biomédica no futuro perceptível. Consequentemente, o sucesso da pesquisa de bioinformatical aumenta a demanda por mais e melhor qualidade dos dados da comunidade de pesquisa biológica e Biomédica, uma tarefa só pode ser alcançada através do avanço da técnica em genômica e proteômica níveis.
Espectrometria de massa (MS) e análise de immunoblot são duas técnicas predominantes de análise de proteínas atualmente. MS tem dominado a pesquisa proteomic nos últimos anos para permitir a análise de milhares de proteínas individuais simultaneamente. As técnicas baseadas em immunoblot, incluindo borrão ocidental e borrão de ponto, por outro lado, também desempenharam um papel significativo na pesquisa da proteína mesmo desde sua invenção1,2,3,4, 5. Enzima lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)5,6,7 e fase reversa proteína microarray (RPPM)8,9 pode ser considerada como o formato de alta taxa de transferência de immunoblot análise. No entanto, todos esses métodos de imunoensaio, exceto ELISA, medem o nível de expressão relativa de uma proteína específica. A natureza relativa desses métodos se tornará um problema real para estudos populacionais, como a análise deve ser feita ao mesmo tempo, impedindo quaisquer esforços para aumentar o tamanho da piscina através de múltiplas análises. Além disso, os resultados derivados destes estudos são apenas semi-quantitativa, assim complicando qualquer Bioinformática na análise dos dados. Entretanto, embora ELISA é bem adequada para análise de absoluto alto throughput de amostras da proteína, esta técnica parece enfrentar desafios em ambientes complexos, tais como células ou tecidos devido a sua capacidade de ligação de baixa e multiplexação de10.
Desenvolvemos um método de immunoblot adequado para estudos populacionais com as principais características de ser conveniente, alta taxa de transferência, quantitativa e apropriada para absoluta determinação do teor de proteína e chamado essa mancha de ponto quantitativa de técnica análise (QDB)11. Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para análise QDB e demonstrar o método de determinação do teor de proteína absoluto de uma proteína específica, a CAPG, em três rato diferentes tecidos, incluindo rins, baço e próstata. Pensamos que este protocolo detalhado ilustra bem a viabilidade e conveniência deste método e fornecer orientações sobre como evitar as armadilhas potenciais na prática desse método.
Entre todas as atuais imunoensaio disponível técnicas de análise de proteínas exceto ELISA, análise do QDB é o único método para alcançar o conteúdo absoluto de uma proteína específica em níveis celular e tecido em um formato de alta taxa de transferência. Embora com padrão rotulado de isótopo estável, espectrometria de massa é capaz de alcançar a quantificação absoluta de algumas proteínas, esse método ainda não é projetado para alto desempenho de throughput. Neste estudo, demonstramos o processo de análise QDB, alcançar absoluta determinação do nível de proteína CAPG nos tecidos do mouse, incluindo rins, baço e próstata. CAPG níveis foram encontrados para ser entre 200 a 360 pg/g em tecidos de rim de rato, 460 para 650 pg/g no baço de rato e 330 para 390 pg/g nos tecidos da próstata do rato.
Em comparação com o ELISA, o QDB análise requer esforços mínimos a ser desenvolvido em um laboratório normal. Em primeiro lugar, a placa do QDB é um baseado em uma membrana de nitrocelulose para eliminar a etapa de revestimento em ELISA. Em segundo lugar, a análise QDB requer apenas um em vez de dois anticorpos específicos em um sanduíche ELISA. Em terceiro lugar, a alta capacidade de ligação da membrana de nitrocelulose em comparação com a superfície da placa ELISA também permite que a membrana suportar as etapas de lavagem rigorosas normalmente usadas na análise immunoblot para reduzir a interferência de fundo. Esse recurso é muito útil na análise complicada lysates preparados a partir de células e tecidos. Em contraste, devido a capacidade de ligação relativamente baixo de placas de ELISA, a redução do plano de fundo quando se analisa o lisado celular e tecido complicado torna-se um verdadeiro desafio no processo de desenvolvimento.
Análise QDB pode ser adotada facilmente em qualquer laboratório com o acesso de um anticorpo específico. No entanto, é importante mencionar que a especificidade do anticorpo é um termo relativo, limitado por fatores, incluindo a espécie, os tipos de tecido e tipos de células. Como mostrado na Figura 1A, CAPG anticorpo é específico ao analisar o lisado de próstata, baço e rim de rato e ainda se torna não-específica ao analisar o fígado de rato. Na verdade, encontramos rotineiramente um anticorpo para ser específico para o tipo de um tecido, mas não é sempre específica para outro tipo de tecido da mesma espécie. Assim, a análise prévia do borrão ocidental é necessário para garantir a especificidade da análise QDB. Na verdade, a especificidade do anticorpo pode ser a causa de resultados falsos, frequentemente associada com análise de ELISA, que não importa quanto esforço pode ter gastado a empresa de fabricação para garantir a especificidade do ensaio, eles não podem esgotar todos os possíveis tipos de amostras, os usuários podem optar por analisar usando seus produtos de ELISA.
Como com todos os imunoensaios, um problema potencial com o método de análise do QDB é a falta de consistência da qualidade do anticorpo comercial. Mesmo se a qualidade aparente de um anticorpo da mesma empresa (mesmo catálogo número, etc) é usada, pode haver grandes diferenças de uma compra para outro devido à variabilidade de lotes. Portanto, a menos que a plena confiança é alcançada na qualidade do anticorpo disponível, re-caracterizar o anticorpo em cima de cada compra é importante.
Em resumo, nós fornecemos aqui um protocolo detalhado e um exemplo ao usar o método de análise do QDB para alcançar absoluta determinação quantitativa de uma proteína específica no nível do tecido. Vamos mostrar que o método de análise do QDB é uma ferramenta conveniente para quem está interessado em alto throughput, análise quantitativa immunoblot. Sua capacidade de atingir a absoluta determinação do conteúdo de uma proteína específica em um nível celular e tecido também distinguir esta técnica de técnicas tradicionais immunoblot. Esta característica permite a combinação e comparação dos resultados de múltiplas análises, um passo necessário, especialmente em maiores estudos de população e a realização dos estudos de associação relevantes a nível de proteína no futuro próximo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por Taishan estudiosos construção engenharia (gt), o prêmio de cientista jovens excelente Shandong (ZR2016JL026 G. T.), Nacional Natural Science Foundation da China (31771284, 3167070448 e 81641108), Shandong provincial natural Fundação de ciência (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provincial ciência e da tecnologia plano (J14LE01 e J15LK03), plan(2015ZH083) de ciência e tecnologia de Yantai e Binzhou médica Universidade científica pesquisa fundos (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), o Conselho de pesquisa Sueco conceder 4423-621-2011 e 2015-4870. Este trabalho também é patrocinado pela “Yantai duplo cem talento plano” e “Yantai Hi-Tech Zone azul oceano talento plano”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |