Her viser vi detaljerte prosessen med kvantitative dot blot analyse (QDB) ved å bestemme absolutt innholdet i en målrettet protein, capping utgangen protein, gelsolin-lignende (CAPG), i tre ulike musen vev. Vi viser en høy gjennomstrømning, praktisk, kvantitativ immunoblot teknikk for biomarkør validering på mobilnettet og vev.
Mangler en praktisk, vanskeliggjør kvantitativ, høy gjennomstrømming immunoblot metoden for absolutt vilje av innholdet i et bestemt protein mobilnettet og vev vesentlig fremdriften i proteomic forskning. Resultatene fra tilgjengelig immunoblot teknikker er også forhold, hindre ethvert forsøk på å kombinere uavhengige studier med en omfattende analyse av protein prøver. I denne studien viser vi prosessen med kvantitative dot blot analyse (QDB) å oppnå absolutt kvantifisering i høy gjennomstrømning format. Bruke en kommersielt tilgjengelig protein standard, er vi finne absolutt innholdet capping utgangen protein, gelsolin-lignende (CAPG) i protein prøver forberedt fra tre forskjellige mus vev (nyre, milt og prostata) sammen med en detaljert forklaring av eksperimentelle detaljene. Vi foreslår QDB analysen som praktisk, kvantitativ, høy gjennomstrømming immunoblot absolutt kvantifisering av personlige proteiner på mobilnettet og vev. Denne metoden vil vesentlig hjelpe biomarkør validation og bekreftelsen av veien i ulike områder av biologiske og biomedisinsk forskning.
Sammen med spennende fremskritt i genomisk forskning i de siste årene, vitner biomedisinsk forskning feltet også til betydelig fremgang i proteomic forskning. Med økende akkumulering av biologiske data på både genomisk og proteomic nivåer, bruker bioinformatic verktøy for å analysere disse dataene har blitt fokus for biomedisinsk forskning i den oppfattes fremtiden. Følgelig suksessen bioinformatical forskning øker etterspørselen etter mer og bedre kvaliteten på data fra biologiske og biomedisinsk forskning samfunnet, en aktivitet kan bare oppnås gjennom teknikk fremgang på genomisk og proteomic.
Massespektrometri (MS) og immunoblot analyse er i dag to rådende teknikker av protein analyse. MS har dominert proteomic forskning i de siste årene å aktivere analyse av individuelle proteiner samtidig. Immunoblot-baserte teknikker, inkludert western blot og dot blot, derimot, har også spilt en viktig rolle i protein forskningen selv siden sin oppfinnelse1,2,3,4, 5. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)5,6,7 og omvendt fase protein microarray (RPPM)8,9 kan betraktes høy gjennomstrømning formatet på immunoblot analyse. Men måle alle disse immunanalyse metoder, unntatt ELISA, relative uttrykk nivået av et bestemt protein. Relativ natur disse metodene vil bli et reelt problem for befolkningsstudier, som analyse må gjøres samtidig, forhindrer ethvert forsøk på å øke utvalgsstørrelsen gjennom flere analyser. Videre er resultatene fra disse studiene bare semi kvantitativ, dermed kompliserer anstrengele bioinformatikk i dataanalyse. I mellomtiden, selv om ELISA er godt egnet for høy gjennomstrømning absolutt analyse av protein prøver, denne teknikken synes å møte utfordringene i komplekse miljøer som eller vev på grunn av sin lave innbindingen behandlingskapasitet og multipleksing10.
Vi har utviklet en metode for immunoblot som er egnet for befolkningsstudier med de viktigste kjennetegnene ved å være praktisk, høy gjennomstrømning, kvantitativ, og passer for absolutt fastsettelse av proteininnhold, og heter denne teknikken kvantitative dot blot analyse (QDB)11. I denne studien vi presentere en detaljert protokoll for QDB analyse og demonstrere metoden ved å bestemme absolutt proteininnholdet i et bestemt protein, CAPG, i tre ulike musen vev inkludert nyre, milt og prostata. Vi tror at denne detaljerte protokollen godt illustrerer gjennomførbarhet og bekvemmeligheten av denne metoden, og gi veiledning om hvordan du unngår potensielle fallgruvene i praksis av denne metoden.
Blant alle nåværende tilgjengelige immunanalyse teknikker av protein analyse unntatt ELISA er QDB analyse den eneste metoden for å oppnå absolutt innholdet i et bestemt protein mobilnettet og vev nivåer i høy gjennomstrømning format. Selv med stabil isotop-merket standard, massespektrometri er dugelig å oppnå absolutt kvantifisering av noen proteiner, er ikke denne metoden ennå utformet for høy gjennomstrømming ytelse. I denne studien viste vi prosessen med QDB analyse å oppnå absolutt vilje CAPG protein nivå i musen vev inkludert nyre, milt og prostata. CAPG nivåer ble funnet for å være mellom 200 til 360 pg/g i mus nyre vev, 460 til 650 pg/g i musen spleens og 330 til 390 pg/g i musen prostate vev.
Sammenlignet med ELISA, krever QDB analyse minimum innsats skal utvikles i en vanlig lab. Først er QDB platen basert på en nitrocellulose membran å eliminere belegg trinnet i ELISA. Andre krever QDB analyse bare en i stedet for to spesifikke antistoffer i en sandwich ELISA. Tredje kan høy bindende kapasitet nitrocellulose membran sammenlignet med ELISA tallerken overflaten også membranen tåle strenge vask fremgangsmåten brukes vanligvis i immunoblot analyse for å redusere bakgrunnen forstyrrelser. Denne funksjonen er svært nyttig i å analysere komplisert lysates celler og vev. Derimot på grunn av den relativt lave innbindingen behandlingskapasitet av ELISA plater blir reduksjon av bakgrunnen når du analyserer komplisert cellular og vev lysates en skikkelig utfordring i utviklingsprosessen.
QDB analyse kan vedtas lett i enhver lab med tilgang til et spesifikt antistoff. Men er det viktig å nevne at spesifisitet av antistoffer er et relativt begrep, begrenset av faktorer, inkludert arter, vev typer og celletyper. Som vist i figur 1A, CAPG antistoffer er bestemt når du analyserer lysate fra mus nyre, milt og prostata, og ennå blir uspesifisert når du analyserer musen leveren. Faktisk vi rutinemessig fant en antistoff å være spesifikke for en vev type, men ikke alltid spesifikke til andre vev type fra samme art. Dermed er tidligere western blot analyse nødvendig for å sikre spesifisitet av QDB analyse. Faktisk, kan relativ spesifisitet av antistoffer være årsaken til falske resultater ofte assosiert med ELISA analyse, som uansett hvor mye arbeid på produksjonsbedrift kan ha brukt slik spesifisitet av analysen, ikke kan de eksos alle mulige typer prøver brukerne kan velge å analysere benytter deres ELISA produktene.
Som med alle immunanalyser, er et problem med metoden QDB analyse mangel på konsistens av kvaliteten på kommersielle antistoffer. Selv om tilsynelatende kvaliteten på et antistoff fra samme brukes selskap (samme katalog tall, etc.), kan det være store forskjeller fra ett kjøp til et annet fordi parti til parti variasjon. Derfor ikke full tillit er oppnådd i kvaliteten på antistoffer tilgjengelig, er nytt karakteriserer antistoffer ved hvert innkjøp viktig.
I sammendraget gir vi her en detaljert protokoll og et eksempel når du bruker metoden QDB analyse for å oppnå absolutt kvantitative fastsettelse av et bestemt protein på vev nivå. Vi viser at metoden QDB analyse er et praktisk verktøy for alle som er interessert i høy gjennomstrømning, kvantitativ immunoblot analyse. Dens evne til å oppnå absolutt vilje av innholdet i et bestemt protein på en mobilnettet og vev også skille denne teknikken fra tradisjonelle immunoblot teknikker. Denne funksjonen gir kombinasjonen og sammenligning av resultatene fra flere analyser, et skritt nødvendige spesielt i større befolkningsstudier og realisering av relevante association studier på protein nivå i nær fremtid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av Taishan forskere bygging Engineering (gt), The Shandong utmerket unge vitenskapsmannen Award (ZR2016JL026 til G. T.), National Natural Science Foundation i Kina (31771284, 3167070448 og 81641108), Shandong provinsielle naturlig Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsielle vitenskap og teknologi (J14LE01 og J15LK03), Yantai naturvitenskapelige plan(2015ZH083) og Binzhou medisinske universitet vitenskapelige forskningsmidler (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18) Svenske Forskningsrådet gir 621-2011-4423 og 2015-4870. Dette arbeidet er også sponset av “Yantai dobbel hundre Talent Plan” og “Yantai Hi-Tech sonen blå havet Talent Plan”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |