Ved at kombinere kvantitative fødeindtagelse Assays og fremtvinge aktivering neuroner for at studere appetit i Drosophila
Summary
Kvantitative fødeindtagelse assays med farvet mad giver en robust og høj overførselshastighed betyder at evaluere fodring motivation. Kombinere mad forbrug assay med thermogenetic og optogenetic skærme er en kraftfuld tilgang til at undersøge de neurale kredsløb underliggende appetit i voksen Drosophila melanogaster.
Abstract
Fødevareforbrug er under stram kontrol af hjernen, som integrerer de fysiologiske status, smagen og ernæringsmæssige indhold i fødevarer og spørgsmål kommandoer til at starte eller stoppe fodringen. Decifrere de processer, der ligger til grund for beslutningstagningen af rettidig og moderat fodring bærer store konsekvenser i vores forståelse af fysiologiske og psykologiske lidelser relateret til fodring kontrol. Enkel, kvantitative og robuste metoder er forpligtet til at måle mad indtagelse af dyr efter eksperimentel manipulation, som med magt stigende aktiviteter af visse mål neuroner. Her, indført vi dye-mærkning-baseret fodring assays for at lette den neurogenetic undersøgelse af fodring kontrol i voksen bananfluer. Vi gennemgå tilgængelige fodring assays, og derefter beskrive vores metoder trin for trin fra opsætning til analyse, som kombinerer thermogenetic og optogenetic manipulation af neuroner kontrollerende fodring motivation med farvestof-mærket mad indtag assay. Vi diskuterer også de fordele og begrænsninger af vores metoder, sammenlignet med andre fodring assays, til at hjælpe læserne med at vælge en passende analyse.
Introduction
Kvantificering af mængden af mad, der indtages er vigtig for evaluering af flere aspekter af fodring kontrol af hjernen i at reagere på interne behov (såsom sult stater) og eksterne faktorer (som fødevarekvalitet og smagen)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. i de seneste år, bestræbelser på decifrere de neurale substrater af fodring kontrol i Drosophila føre til udviklingen af flere assays til direkte at kvantificere mængden af mad indtages eller tjene som en indikator for fodring motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Kapillar FEeder (CAFE) assay12,13 blev udviklet til at måle mængden af forbrug af flydende mad i et glas microcapillary. CAFE assay er meget følsomme og reproducerbare17 og forenkler måling af forbruget af fødevarer, især for kvantificering langsigtede fodring18. Denne analyse kræver imidlertid fluer til at klatre på spidsen af microcapillary og feed hovedet, der er ikke egnet til alle stammer. Derudover fordi fluer skal testes ved hjælp af CAFE analysen skal opdrættes på flydende fødevarer, henstår effekten af disse opdræt betingelser på stofskifte status eller de potentielle underernæring bestemmes.
Snabel udvidelse svar (PER) assay11,14 tæller hyppigheden af Snabel udvidelse svar mod blid hånd mad dråber. PER Analysen viste sig som en glimrende måde at evaluere fodring motivation af individuelle fly og æsler indflydelse af smagen og indholdet i mad18,19. Det er imidlertid ikke en direkte kvantificering af indtag beløb.
For nylig, en halvautomatisk metode, manualen fodring assay (MAFE)15, blev udviklet. I MAFE, er en enkelt immobiliseret flue fodret manuelt med en microcapillary indeholdende mad. I betragtning af at Snabel udvidelse svar og fødevareforbrug kan overvåges samtidigt, er MAFE velegnet til vurdering af næringsstof værdier og effekter af farmakologisk manipulation. Dog kan immobilisere en flue negativ indflydelse sine adfærdsmæssige ydeevne, herunder fodring.
Flyver Derudover Snabel og aktivitet detektor (FlyPAD)10 blev udviklet for at automatisk kvantificere fodring adfærd. Bruger maskinen vision metoder, registrerer FlyPAD fysiske interaktioner mellem en flue og fødevarer til at kvantificere hyppighed og varighed af Snabel udvidelser som en indikator for fodring motivation. FlyPAD giver en høj overførselshastighed tilgang til at overvåge fodring adfærd af en fri bevægelse flyve, selvom følsomhed og robusthed af dette system er fortsat at være yderligere bekræftet af flere undersøgelser12.
Mærkning strategier er ofte bruges til at anslå mad indtagelse i fluer. Det er almindeligt at mærke fødevarer med kemiske sporstoffer og efter fodring, måle mængden af indtaget sporstof til at beregne antallet af fødeindtagelse. Radioaktive sporstoffer16,17,20,21,22,23,24,25 give mulighed for afsløring gennem neglebånd uden homogenisering af fluer. Denne metode giver bemærkelsesværdigt lavt variabilitet og høj følsomhed18, og er muligt for langsigtet undersøgelse af fødeindtagelse. Men, tilgængeligheden af anvendelige radioisotoper og forskellige satser af absorbans og udskillelse bør tages i betragtning når du arbejder med denne analyse.
Mærkningsbestemmelserne og sporing fødeindtagelse med giftfri mad farver er et sikrere og enklere alternativ2,3,26,27,28. Fluer er homogeniseret efter fodring med fødevarer, der indeholder opløselige og ikke-resorberbare farvestoffer, og mængden af de indtagne farvestof kvantificeres senere ved hjælp af et spektrofotometer3,24,28,29 . Den mærkning strategi er let at udføre og giver høj effektivitet, men med en advarsel. Omfanget af fødeindtagelse anslået fra den indtagne farvestof er mindre end den faktiske mængde fordi udskillelse begynder så tidligt som 15 min efter fluer begynde at fodre17. Analysen vurderer derudover mad indtagelse typisk inden for en 60-minutters periode, som er kun egnet til undersøgelse af kortsigtede fodring adfærd24,28. Desuden parret flere interne og eksterne faktorer, såsom genotype17, køn17, stat17, opdræt af densitet30, døgnrytme31,32og mad kvalitet3 , 8 , 16, indflydelse fødeindtagelse. Fodring varighed kan derfor skal tilpasses specifikke forsøgsbetingelser. Udover at lette kvantificering af fødeindtagelse, bruges food farver også til at vurdere mad valg2,19,27, og at visualisere menisk i en microcapillary i CAFE assay12.
Her introducerer vi en protokol kombineret manipulation af neuronal aktivitet med farvestof-mærkning tilgang. Denne strategi har vist sig nyttig i vores neurogenetic undersøgelse af fodring kontrol i voksen bananfluer24. Den visuelle scoring metode giver mulighed for en hurtig vurdering af mad forbrug; Det er således nyttigt for screening gennem et stort antal stammer i tide. Kandidater fra skærmen er derefter analyseret i detaljer ved hjælp af en kolorimetriske metode til at give objektive og præcis kvantificering i yderligere undersøgelse.
Udover de fodring assays beskrive vi også thermogenetic27,33,34,35 og optogenetic36 metoderne til fremtvinge aktivering target neuroner i Drosophila. For at aktivere neuroner ved thermogenetic drift er enkel og praktisk med Drosophila forbigående Receptor potentielle Ankyrin 1 (dTRPA1), som er en temperatur – og spænding-gated kation kanal, der øger neuronal ophidselse når det omgivende temperaturen stiger over 23 ° C33,37; men test dyr ved høje temperaturer kan producere bivirkninger på adfærd. En anden effektiv fremgangsmåde til at aktivere neuronerne i Drosophila bruger optogenetics med CsChrimson36, som er en rød-forskudt variant af channelrhodopsin, der øger ophidselse af neuroner når de udsættes for lys. Optogenetics tilbyder højere tidsmæssige opløsning og mindre forstyrrelser i adfærd end thermogenetics. Kombinerer kvantitativ måling af fødeindtagelse med manipulation af neuronal aktivitet udgør en effektiv tilgang til at studere de neurale mekanismer af fodring.
Vi beskriver i detaljer, forberedelse af fodring kammeret og fluer skal testes. Ved hjælp af Taotie-Gal4 fluer som en model24, beskriver vi aktiverende neuroner ved thermogenetics og optogenetics. To assays af kvantificering af mad forbrug med farvestof-mærket mad er også beskrevet i protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne betænkning fokuserer på den tekniske proces af dye-mærkning fodring assays af mad forbrug inden for rammerne af thermogenetic og optogenetic aktivisering hen til manipulere neuroner kontrollerende fodring. Denne enkle og pålidelige protokol vil bidrage til at belyse funktionen af kandidat neuroner i fodring kontrol, til at måle mad præferencer af fluer, og til at identificere nye spillere i de fodring kontrol kredsløb via fodring-baserede genetiske skærme24.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist understøttet af nationale grundlæggende forskning Program af Kina (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 og 9163210042), kinesiske akademi for Videnskaber (CAS), (GJHZ201302 og QYZDY-SSW-SMC015), Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1119434) og 100-talenter Program af CAS til Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
