양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

Summary

염색 음식 양이 많은 음식 섭취 량 분석 제공 하는 강력한 고 높은 처리량 먹이 동기 평가를 의미 합니다. 결합 식품 소비 분석 결과 thermogenetic 및 optogenetic 스크린은 성인에서 식욕을 기본 신경 회로 조사 하는 강력한 접근 방식을 초파리 melanogaster.

Abstract

식품 소비는 생리 적 상태, palatability, 음식, 그리고 문제 명령을 시작 하거나 수 유 중지의 영양 내용을 통합 하는 두뇌의 꽉 제어. 밑에 시기 적절 하 고 적당 한 먹이 제어와 관련 된 생리 적, 심리적 장애의 우리의 이해에 운반의 주요 의미를 먹이의 의사 결정 프로세스 파악 간단 하 고, 양적, 강력한 메서드는 강제로 특정 대상 뉴런의 활동을 증가 하는 등 실험적인 조작 후 동물의 음식 섭취를 측정 하는 데 필요한. 여기, 우리는 성인 초파리에 제어를 먹이 기의 neurogenetic 연구를 촉진 하기 위하여 먹이 분석 염료-라벨-기반으로 도입. 우리가 사용할 수 먹이 분석, 검토 하 고 우리의 방법 thermogenetic 결합 분석 및 염료 표시 된 음식 섭취 량 분석 결과와 먹이 동기를 제어 하는 신경 세포의 optogenetic 조작 설치에서 단계별 설명. 우리는 또한 장점과 독자 적절 한 분석 결과 선택할 수 있도록 다른 먹이 분석 실험에 비해 우리의 방법의 한계를 설명.

Introduction

섭취 하는 음식의 양을 측정 하는 것이 먹이 (기아 상태) 등 내부 요구와 외부 요인 (예: 식품 품질과 palatability)^1, 에 두뇌에 의해 컨트롤의 여러 측면을 평가 하기 위한 중요 ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. 최근 몇 년 동안, 초파리 에서 제어를 먹이 기의 신경 기질을 해독의 노력 직접 섭취 하는 음식의 양을 계량 또는 동기 부여를 먹이의 지표로 서 역할을 다 분석 실험의 발전으로 이어질 ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

모 세관 급지대 (카페) 분석 결과^12,13 유리 microcapillary에서 액체 식품의 소비 금액을 측정 하기 위해 개발 되었다. 카페 분석 결과 매우 민감하고 재현할 수¹⁷ 이며 음식 소비, 특히 장기 먹이¹⁸측정의 측정을 간소화 합니다. 그러나,이 분석 결과 microcapillary의 끝에 상승 하 고 있는 모든 긴장에 적합 하지 않습니다 거꾸로, 피드 파리를 요구 한다. 또한, 카페 분석 결과 사용 하 여 테스트할 파리 액체 식품에 reared 하기 때문에, 이러한 대사 상태 또는 잠재적인 영양 조건을 양육의 효과 결정 될 남아 있습니다.

코 확장 응답 (%) 분석 결과^11,14 식품 상품의 부드러운 접촉으로 코 확장 응답의 주파수를 계산합니다. 분석 결과 평가 하는 우수한 방법으로 입증 당 palatability의 영향 및 음식^18,19의 내용을 개별 비행 및 엉덩이의 동기 부여를 먹이. 그러나, 그것의 섭취 양 직접 정량화 아니다.

최근, 반자동 방법, 분석 결과 (MAFE)¹⁵, 먹이 매뉴얼 개발 되었다. MAFE에서 하나의 고정된 비행 수동으로 음식을 포함 하는 microcapillary와 함께 먹이입니다. 그 코 확장 반응과 식품 소비를 동시에 모니터링할 수 있습니다, MAFE는 영양 가치와 약리 조작의 효과 평가 적합 합니다. 그러나, 비행을 immobilizing 수 있습니다 부정적인 영향을 행동 성능, 먹이 포함 하 여.

또한, 코를 비행 하 고 활동 검출기 (FlyPAD)¹⁰ 자동으로 먹이 행동 척도를 개발 되었다. 머신 비전 방법을 사용 하 여, FlyPAD 비행 및 동기 부여를 먹이의 지표로 서 주파수와 코 확장의 기간을 계량 하는 음식 간의 실제 상호 작용을 기록 합니다. FlyPAD는 민감도이 시스템의 견고를 더욱 더 남아 있지만 무료 이동 파리의 먹이 행동을 모니터링 하는 높은 처리량 접근 연구¹²제공 합니다.

레이블 전략 자주 파리에 음식 섭취를 추정 하는 데 사용 됩니다. 그것은 일반적인 음식 화학 추적기와 라벨, 수 유, 후 음식 섭취 량의 수량을 계산 하기 위해 섭취 한 추적의 양을 측정. 방사성 트레이 서^{16,17,20,21,22,23,,2425} 표 피를 통해 검색 허용 파리 균질 하지 않고 이 방법은 현저 하 게 낮은 다양성 및 높은 감도¹⁸, 제공 하 고 음식 섭취 량의 장기 유학 가능. 그러나, 사용 가능한 radioisotopes의 가용성 및 흡 광도 배설의 다른 비율 취해야 한다 고려 사항으로이 분석 결과 사용 하는 경우.

라벨링 및 비 독성 식품과 음식 섭취 량을 추적 한 안전 하 고 간단 하 게 대체^2,3,26,,2728이다. 파리는 수용 성 및 비 흡수 염료를 포함 하는 음식을 먹이 후 무 균 그리고 섭취 염료의 금액은 나중에 분 광 광도 계^{3,,2428,29 사용 하 여 계량} . 라벨 전략 수행 쉽습니다 및 높은 효율성을 제공 하지만 경고와 함께. 음식 섭취 량 섭취 염료에서 추정의 볼륨은 배설 파리¹⁷수 유 시작 후 15 분 일찍 시작 되기 때문에 실제 볼륨 보다 작습니다. 또한, 분석 결과 일반적으로 기간 내에 60 분만 단기 먹이 행동^24,28의 조사를 위해 적합 하다는 음식 섭취를 평가 합니다. 또한, 유전자 형¹⁷,¹⁷, 성별 등 여러 내부 및 외부 요인 상태¹⁷, 밀도³⁰,³²circadian 리듬^31,및 식품 품질³ 양육 성관계 ^{, 8 , 16}, 영향 음식 섭취 량입니다. 따라서, 먹이 기간 특정 실험 조건에 따라 조정 해야 합니다. 음식 섭취 량의 정량화를 촉진, 외 식품 식품 선택^2,,1927, 평가 하 고 시각화 카페 분석 결과¹²에 microcapillary에서 초승달 모양에도 사용 됩니다.

여기, 염료 라벨 방식으로 신경 활동의 결합 프로토콜 조작을 소개합니다. 이 전략 성인 과일 파리²⁴제어를 먹이 기에 우리의 neurogenetic 연구에 유용한 입증 되었습니다. 식품 소비;의 빠른 평가 위한 시각적 득점 메서드 사용 따라서, 시기에 종자의 큰 숫자를 통해 심사에 대 한 유용합니다. 화면에서 후보자는 다음 자세히 객관적이 고 정확한 정량화 추가 연구를 제공 하는 색도계 방법을 사용 하 여 분석 됩니다.

먹이 분석 실험, 게다가 우리는 또한 thermogenetic^27,33,34,35 및 optogenetic³⁶ 의 메서드 강제로 대상 초파리에서 신경 세포를 활성화 설명 합니다. Thermogenetic 신경 활성화 작업이 간단 하 고 편리한 초파리 와 일시적 수용 체 잠재적인 Ankyrin 1 (dTRPA1)는 신경 흥분을 증가 온도 및 전압 문을 단 양이온 채널 때 주위 온도 23 ° C^33,37; 올라가면 그러나, 높은 온도에서 동물 테스트 동작에 악영향을 생성할 수 있습니다. 또 다른 효과적인 방법은 초파리 에서 신경 세포를 활성화 하는 사용 optogenetics CsChrimson³⁶, 빛에 노출 되 면 신경 세포의 흥분 성 증가 channelrhodopsin의 빨간색 이동 변종입니다. Optogenetics 더 높은 시간 해상도 thermogenetics 보다 덜 방해 동작을 제공합니다. 신경 활동의 조작으로 음식 섭취 량의 정량적 측정을 결합 하 여 먹이의 신경 메커니즘을 공부에 대 한 효과적인 접근 방식을 나타냅니다.

우리가 먹이 챔버와 파리의 준비 테스트를 자세히 설명 합니다. 본뜬 Gal4 파리를 사용 하 여 모델²⁴, thermogenetics 및 optogenetics에 의해 활성화 신경 설명 합니다. 염료-표시 된 식품 식품 소비의 정량화의 2 개의 분석 실험 또한 프로토콜에서 설명 합니다.

Protocol

1. 먹이 챔버 준비 참고: 먹이 챔버 염료 라벨 먹이 분석 결과 대 한 두 부분으로 구성: (표지)로 외부 컨테이너와 내부 (식량)와 컨테이너. 수정 (31.8 m m 내부 직경)와 80 m m의 높이 초파리 배양에 대 한 유리 병에서 외부 컨테이너 (그림 1A, 1 C). 1 %agarose 제대로 먹이 설치 계속 (5 mL)의 층으로 컨테이너의 하단 습도 및 (<…

Representative Results

Thermogenetic 스크린입니다. 식욕 비정상적으로 증가 하면 생리 적 요구에 높은 음식 섭취 량. 높은 처리량을 디자인 하는이 제도 활용 하는 우리 행동 신경 세포의 유전 핸들을 얻기 위해 기아와 관련 된 화면과 만족 상태 (그림 1). 화면 본뜬 Gal424나왔고. 본뜬 Gal4 뉴런은 강제…

Discussion

이 보고서는 thermogenetic의 맥락에서 소비 식품의 염료 라벨 먹이 분석의 기술 과정에 초점을 맞추고 먹이 제어 하는 optogenetic 활성화 뉴런을 조작 하 고. 이 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜 제어, 파리의 음식 선호도 측정 하 고 먹이 기반 유전 스크린²⁴통해 먹이 제어 회로에 새로운 플레이어를 식별 하 먹이에 후보 뉴런의 기능을 명료 하 게 하는 데 도움이 됩니다.

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Materials

UAS-CsChrimson	Bloomintoon	55135
UAS-dTrpA1	Bloomintoon	26263
TDC1-GAL4	Bloomintoon	9312
TDC2-GAL4	Bloomintoon	9313
sNPF-GAL4			Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4			Provided by Y. Rao
TH-GAL4			Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4			Provided by Y. Rao
AKH-GAL4			Provided by Y. Rao
dip2-GAL4			Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4			Provided by J. Carlson
Agarose	Biowest	G-10
Sucrose	Sigma	S7903
Erioglaucine disodium salt	Sigma	861146
all-trans-retinal	Sigma	R2500	stored in darkness
Triton X-100	Amresco	9002-93-01
Fly food		1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH
1x PBS buffer		1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer		1X PBS with 1% Triton X-100
Grinding mill	Shang Hai Jing Xin	Tissuelyser-24
Incubator	Ning Bo Jiang Nan	HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate	Chang Zhou Bo Yuan	CJJ 78-1
Spectrometer	Thorlabs	CCS200/M
Microplate Spectrophotometer	Thermo Scientific	Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope	Leica	M205FA
Stereo microscope	Leica	S6E
Outside container	Jiang Su Hai Men	glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container	Beijing Yi Ran machinery factory	plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes	Hai Men Ning Mong
96 well plate	Corning Incorporated	Costar 3599
LEDs	Xin Xing Yuan Guangdian	607 nm, 3W	https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058