मात्रात्मक भोजन के संयोजन-परख और जबरन सक्रिय ंयूरॉंस में भूख का अध्ययन करने के लिए Drosophila
Summary
मात्रात्मक भोजन-रंगे भोजन के साथ सेवन परख एक मजबूत और उच्च प्रवाह का मतलब है खिलाने के लिए प्रेरणा का मूल्यांकन प्रदान करते हैं । thermogenetic और optogenetic स्क्रीन के साथ खाद्य उपभोग परख के संयोजन एक शक्तिशाली करने के लिए वयस्क Drosophila melanogaster में भूख अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट की जांच दृष्टिकोण है ।
Abstract
भोजन की खपत मस्तिष्क के तंग नियंत्रण में है, जो शारीरिक स्थिति, तालु, और भोजन के पोषण की सामग्री को एकीकृत करता है, और मुद्दों को शुरू करने के लिए या खिला बंद करो । समय पर और उदारवादी भोजन बनाने के निर्णय अंतर्निहित प्रक्रियाओं को समझने शारीरिक और मनोवैज्ञानिक खिला नियंत्रण से संबंधित विकारों की हमारी समझ में प्रमुख निहितार्थ किया जाता है । सरल, मात्रात्मक, और मजबूत तरीकों प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद पशुओं के भोजन की घूस को मापने के लिए आवश्यक हैं, ऐसे जबरन कुछ लक्ष्य ंयूरॉंस की गतिविधियों में वृद्धि के रूप में । यहां, हम डाई लेबलिंग-आधारित खिला परख वयस्क फल मक्खियों में खिला नियंत्रण के neurogenetic अध्ययन की सुविधा शुरू की । हम उपलब्ध खिला परख की समीक्षा, और फिर हमारे तरीकों का वर्णन द्वारा कदम-सेटअप से कदम विश्लेषण करने के लिए, जो thermogenetic और optogenetic डाई-लेबल खाद्य सेवन परख के साथ खिला प्रेरणा को नियंत्रित करने के न्यूरॉन्स के हेरफेर गठबंधन । हम भी हमारे तरीकों के लाभों और सीमाओं पर चर्चा, अंय खिला परख के साथ तुलना में, मदद करने के लिए पाठकों को एक उचित परख चुनें ।
Introduction
घूस की मात्रा को बढ़ाता है आंतरिक जरूरतों का जवाब देने में मस्तिष्क द्वारा नियंत्रण खिला के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे भूख राज्यों के रूप में) और बाहरी कारकों (जैसे खाद्य गुणवत्ता और तालु के रूप में)1, 2 , 3 , 4 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9. हाल के वर्षों में, कई परख के विकास के लिए Drosophila नेतृत्व में खिला नियंत्रण के तंत्रिका सब्सट्रेटs को समझने के प्रयासों को सीधे भोजन की मात्रा को बढ़ाता है या खिला प्रेरणा का एक संकेतक के रूप में सेवा 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
केशिका फीडर (कैफे) परख12,13 एक गिलास microcapillary में तरल भोजन की खपत की मात्रा को मापने के लिए विकसित किया गया था । कैफे परख अति संवेदनशील है और17 reproducible और भोजन की खपत की माप सरल, विशेष रूप से लंबे समय तक बढ़ाता है,18खिला अवधि के लिए । हालांकि, इस परख मक्खियों microcapillary की नोक पर चढ़ने के लिए और उल्टा फ़ीड की आवश्यकता है, जो सभी उपभेदों के लिए उपयुक्त नहीं है । इसके अतिरिक्त, क्योंकि मक्खियों का परीक्षण किया जा करने के लिए कैफे परख का उपयोग करने के लिए तरल भोजन, चयापचय की स्थिति या संभावित कुपोषण पर इन पालन शर्तों के प्रभाव को निर्धारित किया जाना है पर येते हो ।
सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख11,14 भोजन की बूंदों की कोमल छू की ओर सूंड विस्तार प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति मायने रखता है । प्रति परख एक शानदार तरीका के लिए व्यक्तिगत मक्खी के खिला प्रेरणा का मूल्यांकन और तालु और खाद्य18,19की सामग्री के प्रभाव का आकलन साबित कर दिया । हालांकि, इसका सेवन राशि का सीधा ठहराव नहीं है ।
हाल ही में, एक अर्द्ध स्वचालित विधि, मैनुअल खिला परख (माफे)15, विकसित किया गया था । माफे में, एक सिंगल मैटीरियल फ्लाई मैन्युअल microcapillary युक्त भोजन के साथ खिलाया जाता है । यह देखते हुए कि सूंड विस्तार प्रतिक्रियाओं और भोजन की खपत एक साथ निगरानी की जा सकती है, माफे पोषक तत्वों के मूल्यों और औषधीय हेरफेर के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयुक्त है । हालांकि, एक मक्खी स्थिर खिला सहित अपने व्यवहार के प्रदर्शन, नकारात्मक प्रभाव हो सकता है ।
इसके अतिरिक्त, सूंड और गतिविधि डिटेक्टर मक्खी (FlyPAD)10 को स्वचालित रूप से खिला व्यवहार मात्रा में विकसित किया गया था । मशीन विजन तरीकों का प्रयोग, FlyPAD रिकॉर्ड एक मक्खी और भोजन के बीच शारीरिक बातचीत की आवृत्ति और सूंड एक्सटेंशन की अवधि के लिए खिला प्रेरणा का एक संकेतक के रूप में । FlyPAD एक उच्च प्रवाह के लिए एक मुक्त चलती मक्खी के खिला व्यवहार पर नजर रखने के दृष्टिकोण प्रदान करता है, हालांकि संवेदनशीलता और इस प्रणाली की मजबूती के लिए और अधिक अध्ययन द्वारा पुष्टि की है12रहता है ।
लेबलिंग रणनीतियों अक्सर मक्खियों में खाद्य घूस का अनुमान लगाया जाता है । यह रासायनिक अनुरेखकों के साथ भोजन लेबल करने के लिए आम है और, भोजन के सेवन की मात्रा की गणना करने के लिए घूस अनुरेखक की राशि को मापने के बाद, खिलाने के बाद. रेडियोधर्मी अनुरेखकों16,17,20,21,22,23,24,25 छल्ली के माध्यम से पता लगाने के लिए अनुमति दें बिना मक्खियों के homogenization । इस विधि उल्लेखनीय कम परिवर्तनशीलता और उच्च संवेदनशीलता18प्रदान करता है, और भोजन के सेवन के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए व्यवहार्य है । हालांकि, प्रयोज्य radioisotopes और अवशोषित और उत्सर्जन के विभिंन दरों की उपलब्धता को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब इस परख के साथ काम कर रहे ।
लेबल और गैर विषैले खाद्य रंग के साथ खाद्य सेवन अनुरेखण एक सुरक्षित और सरल विकल्प है2,3,26,27,28। मक्खियों घुलनशील और गैर अवशोषित रंजक युक्त भोजन के साथ खिलाने के बाद homogenized हैं, और घूस डाई की मात्रा बाद में quantified एक spectrophotometer का उपयोग कर रहा है3,24,28,29 . लेबलिंग रणनीति प्रदर्शन करने के लिए आसान है और उच्च दक्षता प्रदान करता है, लेकिन एक चेतावनी के साथ । भोजन की मात्रा का अनुमान लगाया डाई से कम वास्तविक मात्रा से छोटी है, क्योंकि उत्सर्जन के रूप में जल्दी शुरू होता है के रूप में 15 मिनट के बाद मक्खियों17खिला शुरू करते हैं । इसके अतिरिक्त, परख आम तौर पर एक ६०-ंयूनतम अवधि है, जो केवल अल्पकालिक खिला व्यवहार की जांच के लिए उपयुक्त है के भीतर खाद्य घूस का आकलन24,28। इसके अलावा, कई आंतरिक और बाह्य कारकों, जैसे जीनोटाइप17, लिंग17, साथी राज्य17, पालन घनत्व30, circadian ताल31,३२, और खाद्य गुणवत्ता3 , 8 , 16, खाद्य सेवन को प्रभावित करते हैं । इसलिए, फीडिंग अवधि को विशिष्ट प्रायोगिक शर्तों के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । भोजन के सेवन के ठहराव को सुविधाजनक बनाने के अलावा भोजन के रंग भी भोजन के विकल्प2,19,27का आकलन करने के लिए, और कैफे12में एक microcapillary में meniscus कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
यहां, हम डाई लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ एक ंयूरॉन गतिविधि के हेरफेर प्रोटोकॉल संयुक्त परिचय । यह रणनीति वयस्क फल में खिला नियंत्रण पर हमारे neurogenetic अध्ययन में उपयोगी साबित हो गया है24मक्खियों. दृश्य स्कोरिंग विधि भोजन की खपत का एक त्वरित आकलन के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, यह एक समय पर फैशन में उपभेदों की एक बड़ी संख्या के माध्यम से स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है । इसके बाद स्क्रीन से अभ्यर्थियों को अतिरिक्त अध्ययन में वस्तुनिष्ठ एवं सटीक ठहराव प्रदान करने के लिए एक वर्णमिति विधि का प्रयोग करते हुए विस्तार से विश्लेषण किया जाता है ।
खिला परख के अलावा, हम भी thermogenetic27,३३,३४,३५ और optogenetic३६ तरीकों का वर्णन जबरन सक्रिय करने के लक्ष्य ंयूरॉंस में Drosophila। thermogenetic आपरेशन द्वारा न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए सरल और सुविधाजनक है के साथ Drosophila क्षणिक रिसेप्टर संभावित Ankyrin 1 (dTRPA1), जो एक तापमान और वोल्टेज-gated कटियन चैनल है कि न्यूरॉन उत्तेजना बढ़ जाती है जब परिवेश तापमान 23 ° c३३,३७से ऊपर उगता है; हालांकि, उच्च तापमान पर जानवरों के परीक्षण व्यवहार पर प्रतिकूल प्रभाव का उत्पादन हो सकता है । एक और प्रभावी दृष्टिकोण Drosophila में न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए CsChrimson३६के साथ optogenetics का उपयोग कर रहा है, जो एक लाल channelrhodopsin के संस्करण स्थानांतरित कर दिया है कि जब प्रकाश के संपर्क में न्यूरॉन्स की उत्तेजक बढ़ जाती है. Optogenetics thermogenetics से व्यवहार करने के लिए उच्च लौकिक संकल्प और कम अशांति प्रदान करता है । ंयूरॉन गतिविधि के हेरफेर के साथ भोजन के सेवन के मात्रात्मक माप के संयोजन खिला के तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है ।
हम विस्तार से खिला चैंबर की तैयारी का वर्णन और मक्खियों का परीक्षण किया जाएगा । Taotie-Gal4 का प्रयोग एक मॉडल24के रूप में मक्खियों, हम thermogenetics और optogenetics द्वारा सक्रिय ंयूरॉंस का वर्णन । डाई-लेबल वाले भोजन के साथ खाद्य उपभोग की ठहराव की दो परख भी प्रोटोकॉल में बताई गई हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह रिपोर्ट डाई-लेबलिंग thermogenetic और optogenetic सक्रियण के संदर्भ में भोजन की खपत को खिलाने की परख की तकनीकी प्रक्रिया पर केंद्रित है ंयूरॉंस को नियंत्रित करने में हेरफेर । यह सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल खिला नियं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य में चीन के राष्ट्रीय बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2012CB825504), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (९१२३२७२० और ९१६३२१००४२), चीनी विज्ञान अकादमी (कैस) (GJHZ201302 और QYZDY-SSW-SMC015), बिल और मेलिंडा गेट्स द्वारा भाग में समर्थित किया गया था फाउंडेशन (OPP1119434), और १००-कैस के प्रतिभा कार्यक्रम को वाई. झू.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
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