Att kombinera kvantitativa mat-intag analyser och med våld aktivering av nervceller för att studera aptit i Drosophila
Summary
Kvantitativa mat-intag analyser med färgade mat ger en robust och hög kapacitet innebär att utvärdera utfodring motivation. Att kombinera mat konsumtion analysen med thermogenetic och optogenetic skärmar är en kraftfull metod att undersöka neurala kretsar underliggande aptit i vuxen Drosophila melanogaster.
Abstract
Livsmedelskonsumtion är under tät kontroll av hjärnan, som integrerar fysiologiska status, smaklighet och näringsmässiga innehållet i mat, och problem-kommandon för att starta eller stoppa utfodring. Dechiffrera de processer som ligger bakom beslutsfattande lägligt och måttlig utfodring bär stora konsekvenser i vår förståelse av fysiologiska och psykologiska sjukdomar relaterade till utfodring kontroll. Enkel, kvantitativa och robusta metoder krävs att mäta mat intag av djur efter experimentell manipulation, såsom våld öka verksamheten i vissa mål nervceller. Här, infört vi märkning-färgbaserade utfodring analyser för att underlätta neurogenetic studien av utfodring kontroll i vuxen bananflugor. Vi granskar tillgängliga utfodring analyser, och sedan beskriva vår stegvisa från setup till analysen, som kombinerar thermogenetic och optogenetic manipulation av nervceller som styr utfodring motivation med dye-märkt mat intag analys metoder. Vi diskuterar också de fördelar och begränsningar av våra metoder, jämfört med andra utfodring analyser, att hjälpa läsarna att välja en lämplig analys.
Introduction
Kvantifiera mängden mat som intas är viktigt för att utvärdera flera aspekter av utfodring kontroller av hjärnan i svar på interna behov (till exempel hunger staterna) och externa faktorer (såsom livsmedlens kvalitet och smaklighet)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. under de senaste åren ansträngningar dechiffrera de neurala substratesna av utfodring kontroll i Drosophila leda till utvecklingen av flera analyser direkt kvantifiera mängden mat intas eller fungera som en indikator av utfodring motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Den kapillära FEeder (CAFE) assay12,13 utvecklades för att mäta mängden konsumtion av flytande livsmedel i ett glas microcapillary. CAFE analysen är mycket känsliga och reproducerbara17 och förenklar mätning av livsmedelskonsumtion, särskilt för att kvantifiera långfristiga utfodring18. Denna analys kräver dock flugor att klättra till toppen av microcapillary och foder uppochner, som inte är lämplig för alla stammar. Dessutom eftersom flugorna till testas med CAFE-analys måste födas på flytande livsmedel, återstår effekten av dessa uppfödningsförhållanden på metabolism status eller potentiella undernäring bestämmas.
Snabel förlängning svar (PER) assay11,14 räknar frekvensen av snabel förlängning svaren mot milda inslag av mat droppar. PER analys som bevisas som ett utmärkt sätt att utvärdera utfodring motivation enskilda fluga och åsnor påverkan av smaklighet och innehållet i mat18,19. Det är dock inte en direkt kvantifiering av intaget belopp.
Nyligen, en halvautomatisk metod, manuell utfodring assay (MAFE)15, utvecklades. I MAFE matas en enda immobiliserade fluga manuellt med en microcapillary som innehåller mat. Med tanke på att snabel förlängning svaren och livsmedelskonsumtion kan övervakas samtidigt, är MAFE lämplig för att bedöma näringsvärden och effekter av farmakologisk manipulation. Dock kan immobilisera en fluga negativt påverka dess beteende prestanda, inklusive utfodring.
Flyger dessutom Snabel och aktivitet detektor (FlyPAD)10 utvecklades för att automatiskt beräkna utfodring beteende. FlyPAD med maskin vision metoder, och registrerar fysisk interaktion mellan en fluga och mat att kvantifiera frekvens och varaktighet av snabel-tillägg som en indikator på utfodring motivation. FlyPAD ger en hög genomströmning strategi att övervaka utfodring beteenden av en gratis-flytta farten, även om känslighet och robusthet av detta system återstår bekräftas ytterligare av mer studier12.
Märkning strategier används ofta för att uppskatta mat intag i flugor. Det är vanligt att märka livsmedel med kemiska spårämnen och, efter utfodring, mäta mängden intas tracer att beräkna kvantiteten av födointaget. Radioaktiva spårämnen16,17,20,21,22,23,24,25 möjliggör detektion genom nagelbanden utan homogenisering av flugor. Denna metod ger anmärkningsvärt låg variabilitet och hög känslighet18, och är genomförbart för långsiktig studie av födointaget. Dock bör tillgängligheten av användbara radioisotoper och olika priser absorbans och utsöndring beaktas när du arbetar med denna analys.
Märkning och spårning födointag med giftfri mat färger är en säkrare och enklare alternativ2,3,26,27,28. Flugor är homogeniserad efter utfodring med mat som innehåller färgämnen lösliga och icke-absorberbara och mängden intas färgämnet kvantifieras senare med en spektrofotometer3,24,28,29 . Märkning strategin är enkel att utföra och ger hög verkningsgrad, men med en varning. Volymen av födointag beräknas från intagna färgämnet är mindre än den faktiska volymen eftersom utsöndring börjar så tidigt som 15 min efter flugor börja mata17. Dessutom bedömer analysen mat intag vanligtvis inom en 60-minuters period, som är avsedd för utredning av kortsiktiga utfodring beteende24,28. Dessutom parad flera interna och externa faktorer, såsom genotyp17, kön17, staten17, uppfödning densitet30, dygnsrytmen31,32och mat kvalitet3 , 8 , 16, inflytande födointag. Därför behöva hela utfodring justeras enligt specifika försöksbetingelser. Förutom att underlätta kvantifiering av födointag, används mat färger också att bedöma mat val2,19,27, och att visualisera menisken i en microcapillary i CAFE assay12.
Här introducerar vi en protokoll kombineras manipulation av neuronal aktivitet med dye-märkning strategi. Denna strategi har visat sig användbar i vår neurogenetic studie på utfodring kontroll i vuxen bananflugor24. Den visuella poängmetoden möjliggör en snabb uppskattning av livsmedelskonsumtion; Därför är det användbart för screening genom ett stort antal stammar i tid. Kandidater från skärmen sedan analyseras i detalj med en kolorimetrisk metod för att ge objektiv och exakt kvantifiering i ytterligare en studie.
Förutom de utfodring analyserna beskriver vi också thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 metoderna och med våld aktivera target nervceller i Drosophila. Aktivera nervceller genom thermogenetic är användningen enkel och bekväm med Drosophila Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (dTRPA1), som är en temperatur – och spänningskänsliga katjon-kanal som ökar neuronal excitabilitet när omgivande temperaturen stiger över 23 ° C33,37; men kan testa djur vid höga temperaturer ge negativa effekter på beteendet. En annan effektiv metod till aktivera nervceller i Drosophila använder optogenetik med CsChrimson36, vilket är en röd-skiftat variant av channelrhodopsin som ökar retbarhet av nervceller när det exponeras för ljus. Optogenetik erbjuder högre temporal upplösning och mindre störningar för beteenden än thermogenetics. Att kombinera kvantitativa mätningen av födointag med manipulation av neuronal aktivitet representerar ett effektivt tillvägagångssätt för att studera de neurala mekanismerna av utfodring.
Vi beskriver i detalj utarbetandet av utfodring kammaren och flugorna som testas. Med Taotie-Gal4 flugor som en modell24, beskriver vi aktiverande nervceller genom thermogenetics och optogenetik. Två analyser av kvantifiering av livsmedelskonsumtion med dye-märkt mat beskrivs också i protokollet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna rapport fokuserar på den tekniska processen av färgämne-märkning utfodring analyser av livsmedelskonsumtionen i sammanhanget av thermogenetic och optogenetic aktiveringen att manipulera nervceller styra utfodring. Detta enkla och tillförlitliga protokoll hjälper till att belysa funktionen av kandidat nervceller i utfodring kontroll, att mäta mat preferensen av flugor, och att identifiera nya spelare i utfodring styrkretsarna via utfodring-baserade genetiska skärmar24.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds delvis av grundläggande forskning Program Kinas nationella (2012CB825504), National Natural Science Foundation Kina (91232720 och 9163210042), Kinesisk Akademi av vetenskaper (CAS) (GJHZ201302 och QYZDY-SSW-SMC015), Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1119434) och 100-talanger Program för certifikatutfärdare för att Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
