Volym är en viktig parameter om fysiologiska och patologiska egenskaperna hos cellerna. Vi beskriver en fluorescerande utslagning metod så att full-fältmätningar av in vitro- neuronala volym med sub Mikrometerinställning axiella upplösning krävs för analysen av neuriter och dynamiska strukturer antyds i neuronal tillväxt.
Volym är en viktig parameter angående fysiologiska och patologiska kännetecken av nervceller på olika tidsskalor. Nervceller är ganska unika celler angående deras utökade förgrenat morfologier och följaktligen höja flera metodologiska utmaningar för volymmätning. I det särskilda fallet med in vitro- neuronal tillväxt, bör den valda metoden inkluderar sub Mikrometerinställning axiella upplösning kombinerat med full-fält observation på tidsskalor från minuter till timmar eller dagar. Till skillnad från andra metoder som cell form återuppbyggnad med confocal imaging, elektriskt-baserade mätningar eller Atomic Force Microscopy, har den nyligen utvecklade fluorescens utslagning metoden (FXm) potential att uppfylla dessa utmaningar. Men trots att de är enkla i dess princip, kräver genomförandet av en högupplöst FXm för nervceller flera justeringar och en särskild metod. Vi presenterar här en metod baserad på kombinationen av fluorescens utslagning, låg-ojämnheter flera fack mikroflödessystem enheter och slutligen micropatterning att uppnå in vitro- mätningar av lokal neuronala volym. Den höga upplösningen som tillhandahålls av enheten tillät oss att mäta den lokala volymen av neuronala processer (neuriter) och volymen av vissa specifika strukturer som deltar i neuronal tillväxt, såsom tillväxt kottar (GCs).
Exakt kunskap om cellulära volym har uppmärksammats ökat under de senaste åren, driven av frågan om cell storlek homeostas i encelliga mikroorganismer 1 och mer generellt i mitotiska celler 2. Frågan om cellvolym är dock relevant också för efter mitotiska celler, som nervceller utgör en paradigmatisk exempel.
Volymen är faktiskt en viktig signatur av fysiologiska och patologiska händelser vid olika skalor och tidpunkter i neuronala liv, från övergående axonal deformation är associerad till elektrisk aktivitet (millisekund skala) 3 till den oåterkalleliga neuronala svullnad som inträffar under den asymtomatiska fasen av neurodegenerativa sjukdomar (åren hos människa) 4. I största Volymändring sker dock i en mellanliggande tidsskala dagar eller veckor (beroende på den ansedda organismen) under neuronal tillväxt. Utökad och komplexa morfologi av nervceller väcker multiplar frågor, bland vilka regleringen av cellstorleken. Axonal längd och diameter är verkligen hårt reglerad i vivo, med värden som är specifika för varje neuronala typ 5,6.
Dessa frågor, komplexa att hantera i vivo, kan också behandlas på ett förenklat sätt in vitro-. I detta mål krävs en metod tillägnad volymmätning snabbt nog att följa tillväxtdynamik (dvs. i en tidsskala minuter) och kompatibel med observation över timmar eller dagar. Flera metoder har utvecklats under åren för att ge en direkt eller indirekt tillgång till cellulära volym in vitro. Cell återuppbyggnad från confocal imaging är en av dem, men denna metod innebär märkning och upprepade exponeringar för ljus medan du visar en begränsad axiella upplösning på ca 500 nm 7. Observera att dessa två sista nackdelar delvis övervinnas genom en mer sofistikerad och senaste metod som heter galler ljus ark mikroskopi 8. Atomic Force Microscopy har varit användas 9 men denna skanning metod är av kärnan långsam och omständlig. Den fysiska kontakten som det kräver med cellen kan dessutom störa mätningen med tanke på den extrema mjukheten av nervceller 10. Indirekta metoden använder impedans eller resonans har använts för olika cell typer 11, men är otillräcklig för utökad självhäftande celler som nervceller.
En av de mest lovande metoderna bygger på måttet på den uteslutna mängden celler i en nära kammare fylld med ett fluorescerande färgämne. Metoden fluorescens utslagning (FXm) är enkel i sin princip eftersom det kräver ingen märkning, och är lämplig för snabba och långsiktiga optisk avbildning av cellpopulationer med en potentiellt sub optiska axiella upplösning. Mer exakt, beror upplösningen i z på maximal fluorescensintensiteten i kultur kammaren (dvs. i regionen saknar celler) dividerat med det dynamiska omfånget av kameran, även om flera bullerkällor begränsa denna ultimata resolution. Denna metod har varit mycket kraftfullt att följa volymen av migrerar vidhäftande celler 12 eller studera Volymändring under Mitos av däggdjursceller, som noggrant beskrivs i 13. Nervceller utgör emellertid en metodologisk utmaning för FXm med tanke på deras omfattande förgrening in i sub Mikrometerinställning processer.
Vi presenterar här en metod som leder till tillverkning av släta FXm chambers att komma åt med hög precision volym och höjd av neuronala grenar och dynamiska strukturer som deltar i neuronal tillväxt som tillväxt kottar.
Chambers bör ha liknande höjder än objektet att mäta för att optimera axiella upplösning. Därför har vi utformat olika FXm enheter kännetecknas av centrala mätning kammare i tre olika höjder. Den tunnaste (3 µm i höjd) är tillägnad neurite mätning: här låg höjd utesluter soma, som förblir i nära 15 µm hög mellanliggande kammaren. Tjockare centrala chambers (10-12 µm) är tillräckligt höga för att följa den hela celltillväxten. Enheten har även två reservoarer placerade på vardera sidan av den centrala kammaren. Fyra injektion hål (IH) genomförs således och betecknas enligt följande: in- och utlopp tjänar till att införa de cellulära suspensioner i chipet, medan de två andra foder behållarna.
Vi har första fabricerade kalibrering coverslips för höjdmätningar med fotoresist strukturer av känd geometri. Vi har sedan avbildas gratis växande nervceller, men också morfologiskt begränsad nervceller in i micropatterns av vidhäftning.
Volym avbildning av nervceller utgör en utmaning för FXm teknik på grund av de långa och tunna förlängningar av dessa celler. Det här protokollet beskriver varianter av samma typ av mikrofabricerade enhet tillägnad neuron imaging.
Bredvid delarna av mikrofabricerade design, val av målet är grundläggande för fluorescens utslagning imaging och innebär en avvägning mellan laterala upplösning och bildskärpa. Det har visats i 13 att en hög NA som leder till ett djup av fokus mindre än höjden som kammaren inte var skadligt för precisionen för volymmätning om imaging utfördes på fokus och om en tillräcklig marginal lämnas mellan konturen av objektet av i nterest och gränserna för integration ytan. Dock försämrar användningen av en kammare som är mycket högre än skärpedjupet skärpa på grund av fotonen diffusion, vilket jämnar ut kanterna av anmärker av intresserar. Tillverkning av en 3 µm hög kammare minskar denna laterala oskärpa och förutsatt exceptionellt väl definierade fluorescerande utslagning bilder även med hög NA (0,8) 40 X mål att visualisera neuronala grenar laterala med hög upplösning.
Chip montering är ett kritiskt steg, särskilt när det gäller 3 µm hög chambers, men försiktig manipulation som beskrivs i punkt 4.1.2 undviker kollapsen av taket. Kicken ytbehandlar volym-förhållande som är kopplade till dessa tunna kammare upp även frågan om stabiliteten i Dextran koncentration över tid. Vi har kontrollerat att ytan absorptionen av Dextran efter en natt av inkubering var försumbar: efter ersättande Dextran av PBS, är skillnaden i stödnivå mellan pelaren och bakgrunden var ungefär 1 per 1000 av den ursprungliga intensitet kontrasten mellan dessa två regioner i närvaro av Dextran. Observera att nervceller kan följa både på det nedre täckglaset och på PDMS taket. Denna effekt försvinner när med mönstrade coverslips (dvs. när vi inte Inkubera självhäftande molekyler inom PDMS kammaren), som beläggningen är därför strängt lokaliserade nedtill på kammaren.
Förutom sin utmanande morfologi, nervceller är snarare lämpade för FXm på grund av att en av den största begränsningen av metoden, dvs dextran endocytos, är mycket begränsad i dessa celler. Vi väljer en 10 kDa formulering att undertrycka på lång räckvidd (timmar) någon synlig endocytos fenomen.
Sammanfattningsvis, balanseras konceptuella enkelheten i FXm av en rad experimentella problem som har lösts av detta protokoll, till exempel nanometriska PDMS strävhet och Mikrometerinställning kammare höjd eller bakgrundskorrektion att korrigera för unevennessen av PDMS taket mellan pelarna. Men ger användningen av en nära mikroflödessystem kammare att begränsa det fluorescerande mediet några särskilda begränsningar som behovet av stödpelarna, vilket sänker den effektiva ytan för celladhesion, eller nödvändigheten att utesluta soma från central kammare att iaktta neuronala förlängningar med den högsta klarhet, som begränsar regionerna i cellen tillgänglig för högupplösta observation. En möjlig utveckling av denna metod skulle vara att bli av med denna fysiska inneslutningen, för att ersättas av en optisk. Den nya utvecklingen av lätta blad mikroskopi kan kombineras med fördel med FXm i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna ChiLab, material och Microsystems laboratorium – Politecnico di Torino – DISAT, i personen av Prof. C F Pirri, Dr M Cocuzza och Dr S L Marasso, för deras värdefulla stöd i processutveckling och enheten fabrication. Vi tackar Victor Racine från Quantacell för diskussion och stöd i bildbehandling. Vi är tacksamma att Isabelle Grandjean och Manon Chartier från djur anläggning av Institut Curie för deras stöd för möss, och Pablo Vargas och Ana-Maria Lennon (Institut Curie) för att förse oss med GFP LifeAct möss. Vi är tacksamma att Olivier Thouvenin från Institut Langevin och Clotilde Cadart, Larisa Venkova och Matthieu Piel från Institut Curie – UMR 144, för deras hjälp i förståelsen av fluorescens uteslutandet metod. Slutligen tackar vi den tekniska plattformen av Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) för deras stöd i mikrofabrikation. Detta arbete stöds delvis av den europeiska forskningen rådet Advanced Grant nr 321107 ”CellO” PSL Université (SwithNeuroTrails-projektet), ANR Investissement pris, och IPGG Labex och Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |