Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.
Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen op verschillende tijdschema’s. Neuronen zijn vrij uniek cellen met betrekking tot hun uitgebreide vertakte morphologies en dus verschillende methodologische uitdagingen voor volumemeting te verhogen. In het bijzondere geval van de in vitro neuronale groei dient de gekozen methodologie sub Micrometrische axiale resolutie gecombineerd met full-veld Opmerking over tijdschema’s van minuten tot uren of dagen. In tegenstelling tot andere methoden zoals cel vorm wederopbouw met behulp van de confocal imaging, elektrisch gebaseerde metingen of Atomic Force microscopie, heeft de onlangs ontwikkelde fluorescentie uitsluiting methode (ITA) het potentieel om te voldoen aan deze uitdagingen. Echter, hoewel ze eenvoudig zijn principieel, uitvoering van een hoge resolutie FXm voor neuronen vereist meerdere aanpassingen en een speciale methodologie. Hier presenteren we een methode gebaseerd op de combinatie van fluorescentie uitsluiting, lage-ruwheid meerdere compartimenten microfluidic apparaten, en tot slot micropatterning om in vitro metingen van lokale neuronale volume. De hoge resolutie geboden door het apparaat konden we voor het meten van het lokale volume van neuronale processen (neurites) en het volume van sommige specifieke structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei, zoals groei kegels (GCs).
De precieze kennis van cellulaire volume heeft verhoogde aandacht getrokken in het afgelopen jaar, gedreven door de kwestie van de cel grootte homeostase in eencellige micro-organismen 1 , en meer in het algemeen in mitotische cellen 2. De vraag van cel volume is echter relevant ook voor post mitotische cellen, waarvoor neuronen een paradigmatische voorbeeld vormen.
Volume is inderdaad een belangrijke handtekening van fysiologische en pathologische gebeurtenissen op verschillende schalen en tijdstippen in neuronale leven, van voorbijgaande axonale vervorming geassocieerd met elektrische activiteit (milliseconde schaal) 3 tot en met de onomkeerbare neuronale zwelling die zich voordoen tijdens de asymptomatische fase van neurodegeneratieve ziekten (jaren bij de mens) 4. Echter, de grootste volumeverandering gebeurt in een tussentijdse tijdschaal voor dagen of weken (afhankelijk van het beschouwde organisme) tijdens de neuronale groei. De uitgebreide en complexe morfologie van neuronen aanleiding tot veelvouden kwesties, waaronder de regulering van de celgrootte. Axonale lengte en diameter zijn inderdaad strak gereguleerde in vivo, met waarden die specifiek zijn voor elke neuronale type 5,6.
Deze kwesties, complexe aan te pakken in vivo, kunnen ook worden behandeld in een vereenvoudigde manier in vitro. In dat streven, een methode die is gewijd aan de volumemeting snel genoeg groeidynamiek (d.w.z. binnen een tijdschaal van minuten) en compatibel met observatie over uren of dagen te volgen is vereist. Verschillende methoden zijn ontwikkeld in de jaren voor een directe of indirecte toegang tot cellulaire volume in vitro. Cel wederopbouw van confocal beeldvorming is een van hen, maar deze methode houdt labeling en herhaalde blootstelling aan licht terwijl een beperkte axiale resolutie van ongeveer 500 nm 7wordt weergegeven. Merk op dat deze twee laatste nadelen gedeeltelijk worden overwonnen door een meer verfijnd en recente methode met de naam lattice licht vel microscopie 8. Atomic Force microscopie is gebruikte 9 maar deze scanmethode gebruikt is door essentie traag en saai. Bovendien is het fysiek contact dat het vereist met de cel kan interfereren met de meting gezien de extreme zachtheid van neuronen 10. Indirecte methode met behulp van impedantie of resonantie hebben gewerkt voor andere cel typen 11, maar zijn niet voldoende voor uitgebreid zelfklevende cellen zoals neuronen.
Een van de meest veelbelovende methoden is gebaseerd op de maatregel van het uitgesloten volume van cellen in een nauwe kamer gevuld met een fluorescente kleurstof. De fluorescentie uitsluiting methode (ITA) is eenvoudig in het principe, want het vereist geen etikettering, en is geschikt voor optische beeldvorming van de snelle, op lange termijn van cel populaties met een potentieel sub optische axiale resolutie. Meer precies, hangt de resolutie in z af van de intensiteit van de maximale fluorescentie in de cultuur-zaal (dat wil zeggen regio verstoken van cellen) gedeeld door het dynamisch bereik van de camera, hoewel verschillende bronnen van geluidshinder deze uiteindelijke resolutie beperken. Deze methode is zeer krachtig te volgen van de omvang van de migratie Adherente cellen 12 of studeren volumeverandering tijdens de mitose van zoogdiercellen, zoals grondig beschreven in 13. Neuronen vormen echter een methodologische uitdaging voor FXm overwegen hun uitgebreide restanten in sub Micrometrische processen.
Wij presenteren hier een methode die leidt tot de fabricage van soepele FXm kamers tot met hoge precisie het volume en hoogte van neuronale takken en dynamische structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei als de groei kegels.
Kamers moeten soortgelijke hoogten dan het object om te meten om te optimaliseren axiale resolutie. Daarom ontwierpen wij verschillende FXm apparaten gekenmerkt door centrale meting kamers van drie verschillende hoogtes. De dunste (3 µm in hoogte) is gewijd aan neurite meting: deze lage hoogte sluit soma, die in de in de omgeving van 15 µm hoge tussenliggende bedwelmingsruimte blijven. Dikkere midden kamers (10 en 12 µm) zijn voldoende hoog te volgen de hele celgroei. Het apparaat bevat ook twee reservoirs, gelegen aan weerszijden van de centrale kamer. Vier injectie gaten (IH) dus ten uitvoer worden gelegd en worden aangewezen als volgt: de inlaat en uitlaat dienen in te voeren van de cellulaire schorsingen in de chip, overwegende dat de twee anderen feed de reservoirs.
We hebben de eerste verzonnen kalibratie coverslips voor hoogte metingen met behulp van fotoresist structuren van de bekende meetkunde. We hebben vervolgens gratis groeiende neuronen, maar ook morfologisch beperkte neuronen beeld in micropatterns van hechting.
Volume beeldvorming van neuronen vormt een uitdaging voor de FXm techniek als gevolg van de lange en dunne extensies van deze cellen. Dit protocol beschrijft varianten van hetzelfde type van microfluidic apparaat gewijd aan neuron imaging.
Naast de aspecten van microfluidic ontwerp, de keuze van de doelstelling is van fundamenteel belang voor fluorescentie uitsluiting beeldvorming en impliceert een trade-off tussen laterale resolutie en de helderheid van de afbeelding. In 13 is gebleken dat een hoge nb leidt tot een diepte van de focus kleiner is dan de hoogte van de kamer niet schadelijk voor de precisie van de volumemeting van het was als imaging werd uitgevoerd bij focus en een voldoende marge tussen de omtrek van het object van i overblijft nterest en de grenzen van het oppervlak van de integratie. Echter, het gebruik van een kamer veel hoger dan de diepte van de focus schaadt de beeldhelderheid als gevolg van foton diffusie, welke worden de randen van de objecten van belang. De fabricage van een hoge kamer van 3 µm verminderd deze laterale vervaging en mits uitzonderlijk goed gedefinieerde fluorescerende uitsluiting beelden zelfs met behulp van hoge nb (0.8) 40 X doelstellingen te visualiseren van neuronale takken met hoge zijdelingse resolutie.
Chip montage is een cruciale stap, met name in het geval van 3 µm hoge kamers, maar voorzichtig manipulatie zoals beschreven in punt 4.1.2 vermijdt het instorten van het dak. De hoge oppervlakte volumeverhouding geassocieerd met deze dunne kamers kwestie ook de van de stabiliteit van Dextran concentratie na verloop van tijd. Wij hebben gecontroleerd dat de oppervlakte absorptie van de Dextran na één nacht van incubatie verwaarloosbaar was: na het vervangen van Dextran door PBS, was het verschil in intensiteit tussen de pijler en de achtergrond ongeveer 1 per 1000 van het contrast van de eerste intensiteit tussen deze twee regio’s in het bijzijn van Dextran. Opmerking dat neuronen op de bodem dekglaasje aan zowel op het PDMS dak houden kunnen. Dit effect verdwijnt wanneer met behulp van patroon coverslips (dat wil zeggen wanneer we niet zelfklevende moleculen in de vergaderzaal van het PDMS broeden doen), als de coating is dan ook strikt gelokaliseerd op de bodem van de kamer.
Afgezien van hun uitdagende morfologie, neuronen zijn eerder geschikt voor FXm wijten aan het feit dat een van de belangrijkste beperking van de methode, d.w.z. dextran endocytose, zeer beperkt is in deze cellen. We kiezen een 10 kDa formulering te onderdrukken in de lange bereik (uren) verschijnselen zichtbaar endocytose.
Kortom, is de conceptuele eenvoud van FXm gecompenseerd door een aantal experimentele problemen die zijn opgelost door het huidige protocol, zoals nanometric PDMS ruwheid en Micrometrische kamer hoogte of achtergrondcorrectie om te corrigeren voor de oneffenheden van het PDMS plafond tussen pijlers. Echter, het gebruik van een nauwe microfluidic kamer te beperken van het fluorescerende medium levert een paar specifieke beperkingen zoals de noodzaak van steun de pijlers, die het effectieve oppervlak beschikbaar voor cel adhesie, of de noodzaak verlaagt om het soma uitsluiten van de centrale kamer te observeren van neuronale extensies met de hoogste helderheid, die de regio’s van de cel die toegankelijk zijn voor hoge resolutie observatie beperkt. Een mogelijke evolutie van deze methode zou zijn om zich te ontdoen van deze fysieke opsluiting, worden vervangen door een optische. De nieuwe ontwikkeling van lichte blad microscopie kan gecombineerd worden voordelig met FXm in de toekomst.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen erkennen ChiLab, materialen en Microsystems laboratorium – Politecnico di Torino – DISAT, in de persoon van Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza en Dr. S L Marasso, voor hun waardevolle hulp bij de procesontwikkeling en fabricage van het apparaat. Wij danken Victor Racine van Quantacell voor discussie en ondersteuning in de beeldverwerking. Wij zijn dankbaar aan Isabelle Grandjean en Manon Chartier uit het dier faciliteit van het Institut Curie voor hun steun voor muizen, en Pablo Vargas en Ana-Maria Lennon (Institut Curie) voor het verstrekken van ons met de LifeAct van GFP-muizen. We zijn dankbaar Olivier Thouvenin uit Institut Langevin en Clotilde Cadart, Larisa Venkova en Matthieu Piel van het Institut Curie – UMR 144, voor hun hulp bij het begrijpen van de fluorescentie uitsluiting methode. Tot slot, wij danken het technologische platform van Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) voor hun steun in microfabrication. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Europese onderzoek Raad Advanced Grant No. 321107 “CellO,” PSL Université (SwithNeuroTrails project), ANR Investissement d’Avenir, IPGG Labex en de Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |