종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

Summary

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

Abstract

히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.

Introduction

포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직^1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스^3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴^{6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910}.

최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필¹¹공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된^12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가¹⁴를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구^{15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터} 정상 조직 및 세포에서 ^22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.

Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정^15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모^25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 “금 표준” 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직^{28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발} . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량^33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq³⁵ 등 은³⁶사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.

이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 ³⁷이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.

Protocol

모든 임상 표본은 기관 검토 위원회의 지침에 따라 얻은 했다. 1. 버퍼 준비 TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0) 200 mL를 확인 합니다. STE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL를 확인 합니다. 2.0 M 글리신 (37.52 g 물 200 mL에 글리신의)의 200 mL 고 65 ° c 열 200 mL의 5% 나트륨 deoxycholate (DOC) 솔루션 물 200 mL에 DOC (10 g)을 확…

Representative Results

이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했?…

Discussion

이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실^42,,4445 에 검증에 대 한 immun…

Materials

ChIP-grade H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody	Abcam	ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody	Abcam	ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody	Abcam	ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody	Abcam	ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody	Abcam	ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0	Teknova	T1080
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
DPBS	Sigma – Life Sciences	D8537-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	74255
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100-100ML
LiCl	Sigma-Aldrich	746460
NP-40	Calbiochem	492016-100ML
1% TWEEN-20	Fisher Bioreagents	BP337-500
BSA – IgG-free	Sigma – Life Sciences	A2058-5G
HBSS	Gibo	14025092
GentleMACS C tube	GentleMACS	120-008-466	disassociation tube
16% Formaldehyde	Peierce	28906
miniProtease inhibitor	Roche Diagnostics	11836153001	protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL	Diagenode	C30010011	sonication tubes
DynaMag – 96 Side Skirted	Invitrogen	120.27	96-well magnetic stand
TE buffer	Promega	V6231
RNase A	Invitrogen	12091021
Proteinase K	Invitrogen	100005393
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	paramagnetic beads
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q32854	high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	New England BioLabs	E7645L	DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584	high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents	Agilent Technologies	5067-5585	high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)	New England BioLabs	E7335L	Multiplex Oligos
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)	New England BioLabs	E7500L	Multiplex Oligos
TapeStation 4200	Agilent Technologies	G2991AA	high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device	Diagenode	B01060001	water bath disruputor
Mixer	Nutator	421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851196	PCR Thermal cycler
Water Bath	Fisher Scientific	2322
Multichannel Pipet	Denville	1003123
Tube Revolver	Thermo-Scientific	88881001
96-Well Skirted Plate	Eppendorf	47744-110
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter	A99464	benchtop centrifuge
Centrifuge 5424	Eppendorf	22620461	tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)	Agilent Technologies	401428
Optical tube strip caps (8x strip)	Agilent Technologies	401425
Loading Tips, 10 Pk	Agilent Technologies	5067-5599
IKA MS3 vortex	IKA	3617000	vortex