Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe
Summary
Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.
Abstract
Histon-Modifikationen stellen eine wichtige Komponente des das epigenom und eine wichtige regulatorische Rolle bei der Bestimmung der transkriptionellen Status der zugehörigen Loci. Darüber hinaus hat das Vorhandensein von spezifischen Änderungen verwendet worden, die Position und nicht-kodierenden Funktionselemente wie Enhancer für Identität bestimmen. In den letzten Jahren geworden Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-Seq) ein mächtiges Werkzeug bei der Bestimmung der genomweiten Profile der einzelnen Histon-Modifikationen. Jedoch ist es immer deutlicher geworden, dass die kombinatorische Muster von Chromatin Modifikationen, als Chromatin Staaten bezeichnet die Identität und die Natur von der damit verbundenen genomischen Locus bestimmen. Daher, bestehend aus robusten Hochdurchsatz-(HT) Methoden für die Profilerstellung einer Reihe von Histon Modifikation Marken sowie computergestützte Analysen Rohrleitungen in der Lage, Arbeitsabläufe Umgang mit Myriaden von ChIP-Seq profiling Datasets, sind notwendig für umfassende Ermittlung der epigenomischen Staaten in große Anzahl von Proben. Die HT-ChIP-Seq-Workflow, die hier vorgestellten besteht aus zwei Modulen: 1) ein experimentelles Protokoll für die Profilerstellung mehrere Histon-Modifikationen von geringen Mengen an tumorproben und Zell-Linien in einem 96-Well-Format; und 2) eine numerische Daten-Analyse-Pipeline, die vorhandenen Tools zur Berechnung der einzelnen Mark Belegung und kombinatorische Chromatin Zustand Muster kombiniert. Zusammen ermöglichen diese beiden Module einfache Verarbeitung von Hunderten von ChIP-Seq-Proben in eine schnelle und effiziente Weise. Die hier vorgestellten Workflow wird verwendet, um 6 Histon Mark Profile in Melanom Tumoren und Zelllinien Chromatin Zustand Muster abgeleitet. Insgesamt präsentieren wir Ihnen einen umfassende ChIP-Seq-Workflow, der die Dutzende von menschlichen tumorproben und Krebszelllinien festzustellen, epigenomischen Aberrationen in verschiedenen Tumoren angewendet werden kann.
Introduction
Die Mehrheit der Säugetier-Genome (98-99 %) bestehen aus Nichtkodierende Sequenz, und diese Nocoding-Regionen enthalten regulatorische Elemente bekannt, bei der Kontrolle der Genexpression und Chromatin Organisation1,2teilzunehmen. In einer normalen Zelle ist die angegebene Assembly genomic DNA in verdichteten Chromatinstruktur entscheidend für die räumliche Organisation, Regulierung und präzises Timing von verschiedenen DNA-assoziierten Prozesse3,4,5. In eine Krebszelle führen jedoch Chromatin Modifikationen von aberranten epigenetischen Mechanismen zu unsachgemäßen Organisation von Chromatinstruktur, einschließlich des Zugangs zu regulatorischen Elemente, chromosomale Schleife Systeme und Gen Ausdruck Muster6, 7,8,9,10.
Trotz der jüngsten Fortschritte haben wir Verständnis für epigenetische Veränderungen beschränkt, die Tumorprogression oder therapeutische Reaktion zugeordnet sind. Das epigenom besteht aus einer Reihe von Änderungen, einschließlich Histon Marks und DNA-Methylierung, die bilden zusammen einen dynamischen Zustand (bezeichnet als Chromatin-Staat), der bei der Gen-Expression-Netzwerken und anderen Prozessen entscheidend für die Aufrechterhaltung der auftrifft zelluläre Identität. Vor kurzem wurden Änderungen in Enhancer in mehreren Malignome gezeigt, durch das Studium der H3K27Ac profile11. Obwohl solche Studien in die Korrelation von isolierten epigenetischen Markierungen Einblick, wurden mehr als 100 epigenetische Modifikationen identifizierten12,13 ohne klares Verständnis ihrer biologischen Rollen und Interdependenz. Darüber hinaus gibt es eine noch größere Anzahl von möglichen kombinatorische Muster dieser Histon und DNA-Veränderungen, und es ist diese kombinatorische Muster – keine individuelle Anpassungen -, die epigenetische Staaten14diktieren. Daher gibt es enormen Bedarf zur Identifikation von Veränderungen in diesen Staaten Chromatin während Tumorprogression oder Reaktionen auf die Therapie. Umfassende Kenntnisse der epigenom Änderungen bei Krebsarten hat teilweise aufgrund von technischen (z. B. Erzeugung von großen Datenmengen aus kleinen Menge an klinischen Material/einzelne Zellen) hinken und analytische (z.B. Algorithmen zu definieren Kombinatorische Staaten) Herausforderungen. Daher gibt es kritische Notwendigkeit für robuste Hochdurchsatz-Methoden für die Profilerstellung große Anzahl von Histon Modifikation Markierungen von klinischem Material und einfach zu implementierende rechnerische Ansätze, kombinatorische Muster vorherzusagen, die erleichtert Bestimmung der epigenetischen Staaten mit verschiedenen Stufen der Tumorgenese und therapeutischen Widerstand verbunden. Darüber hinaus verfügbaren Daten aus den letzten epigenom profiling Studien15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normalen Geweben und Zelllinien mit Chromatin Profile von Tumoren für weitere Einblicke in epigenom Beitrag zur Tumorbiologie integriert werden können.
Chromatin-profiling ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Ermittlung der global verbindliche Muster von verschiedenen Chromatin Änderungen15,24geworden. In den letzten Jahren ist die ChIP-Seq der “Goldstandard” für die Untersuchung von DNA-Protein Interaktionen auf einer globalen Skala25,26,27geworden. Für jeden ChIP-Seq-Experiment sind wichtige Schritte für seinen Erfolg, einschließlich Gewebe Verarbeitung und Dissoziation, bestimmen optimale Beschallung Bedingungen bestimmen optimale antikörperkonzentration für Niederschlag, Bibliothek Vorbereitung notwendig, nach Abschluss der Sequenzierung Datenverarbeitung und nachgelagerte Analyse. Jeder dieser Schritte enthalten wichtige Qualitätskontrolle Prüfpunkte und zusammengenommen sind ausschlaggebend für richtig identifizieren potenzielle Ziele für die funktionelle Validierung. Durch Innovation in den folgenden Schritten haben mehrere vorherige Studien Methoden zum Ausführen von ChIP oder ChIP-Seq aus kleine Menge an Gewebe28,29,30,31,32 entwickelt. . Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, Protokolle für Hochdurchsatz-ChIP Experimente gefolgt von PCR-basierte Quantifizierung33,34. Schließlich sind einige öffentlich zugängliche Analyse Plattformen für ChIP-Seq-Daten jetzt wie Easeq35 und Galaxy36zur Verfügung. Allerdings hat eine integrierte Plattform für die Durchführung von ChIP-Seq in eine Hochdurchsatz-Mode in Kombination mit einer rechnerischen Pipeline einzelne Markierung sowie Chromatin-Zustand-Analysen durchführen gefehlt.
Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen und umfassenden ChIP-Seq-Workflow für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten im Tumorgewebe und Zell-Linien, mit leicht Richtlinien umfasst alle die notwendigen Schritte für ein gelungenes Experiment. Durch die Annahme einer Hochdurchsatz-Methode zuvor von Blecher-Gonen Et Al. beschrieben 37, dieses Protokoll auf Dutzenden von Proben parallel durchgeführt werden kann und auf Krebszelllinien und menschlichen Tumoren wie Melanom, Dickdarm, Prostata und Glioblastoma Multiforme erfolgreich angewendet wurde. Wir zeigen die Methodik für die sechs Kern-Histon-Modifikationen, die Schlüsselkomponenten der epigenetischen regulatorischen Landschaft im menschlichen Melanom-Zelllinien und tumorproben darstellen. Diese Änderungen umfassen H3K27ac (Enhancer), H3K4me1 (aktive und Balanciert, Enhancer), H3K4me3 (Promotoren), H3K79me2 (transkribiert Regionen), H3K27me3 (Polycomb Repression) und H3K9me3 (heterochromatischen Repression). Diese Markierungen können entweder allein oder in Kombination verwendet werden, um funktionell unterschiedlichen Chromatin Staaten repräsentieren sowohl repressive als auch aktive Domains zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige und umfassende Hochdurchsatz-ChIP-Seq-Modul für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten in menschlichen Tumorgewebe und Zell-Linien. In jedem ChIP-Seq-Protokoll ist einer der wichtigsten Schritte Antikörperbesonderheit. Hier veranschaulicht diese Methode Immunopräzipitation Bedingungen für die beschriebenen sechs Histon Änderungen, von die alle sind ChIP-Klasse und wurden zuvor in unserer und anderer Labors42,44</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF Kern am MDACC für Sequenzierung Unterstützung. Die in diesem Artikel beschriebene Arbeiten wurde unterstützt durch Zuschüsse von der NIH-Zuschuss (CA016672), SMF Kern und NCI vergibt (1K99CA160578 und R00CA160578) an K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
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