Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore
Summary
Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.
Abstract
Modificazioni istoniche costituiscono una componente importante dell’epigenoma e svolgono un ruolo importante regolamentazione nella determinazione dello stato trascrizionale di loci associati. Inoltre, la presenza di modifiche specifiche è stata utilizzata per determinare la posizione e l’identità non codificanti elementi funzionali come rinforzatori. Negli ultimi anni, immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è diventato un potente strumento nel determinare i profili di genoma di modificazioni istoniche individuali. Tuttavia, è diventato sempre più chiaro che i modelli combinatoriali delle modificazioni della cromatina, denominati Stati della cromatina, determinano l’identità e la natura del locus genomico associato. Pertanto, i flussi di lavoro costituito da metodologie di (HT) robusti ad alta produttività per l’analisi di un numero di segni di modifiche dell’istone, nonché condotte analisi computazionali capaci di gestire miriadi di ChIP-Seq profilatura DataSet, sono necessari per completa determinazione degli Stati di epigenomic in gran numero di campioni. Il HT-ChIP-Seq flusso di lavoro qui presentato è costituito da due moduli: 1) un protocollo sperimentale per la profilatura diverse modificazioni istoniche da piccole quantità di campioni tumorali e linee cellulari in un formato a 96 pozzetti; e 2) una pipeline di analisi computazionale dati che combina gli strumenti esistenti per calcolare sia marchio individuale occupazione e modelli di stato della cromatina combinatoria. Insieme, questi due moduli facilitano facile elaborazione di centinaia di campioni di ChIP-Seq in maniera veloce ed efficiente. Il flusso di lavoro qui presentato è utilizzato per derivare modelli di stato della cromatina da 6 profili di contrassegno dell’istone in linee cellulari e tumori del melanoma. Nel complesso, vi presentiamo un flusso di lavoro completo di ChIP-seq che possa essere applicato a decine di campioni tumorali umani e linee cellulari di cancro per determinare aberrazioni epigenomic in varie malignità.
Introduction
La maggior parte del genoma di mammiferi (98-99%) è costituita di sequenza non codificante, e queste regioni nocoding contengono elementi regolatori noti per partecipare nel controllare l’espressione genica e della cromatina organizzazione1,2. In una cellula normale, l’assembly specifico del DNA genomico in struttura della cromatina compattato è critica per l’organizzazione spaziale, regolamento e tempi precisi di vari processi DNA-collegato3,4,5. In una cellula tumorale tuttavia, modificazioni della cromatina di meccanismi epigenetici aberranti possono portare alla errata organizzazione della struttura della cromatina, compreso l’accesso a elementi regolatori, sistemi di loop cromosomiche e gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Nonostante i recenti progressi, abbiamo limitato comprensione delle alterazioni epigenetiche che sono associati con la progressione del tumore o risposta terapeutica. L’epigenoma è costituito da una matrice di modifiche, tra cui marchi dell’istone e metilazione del DNA, che collettivamente formano uno stato dinamico (denominato stato di cromatina) che incide su reti di espressione genica e altri processi critici per il mantenimento identità cellulare. Recentemente, le alterazioni in esaltatori sono state indicate in malignità multiple studiando H3K27Ac profili11. Sebbene tali studi consentono di comprendere la correlazione dei marchi epigenetici isolati, più di 100 modificazioni epigenetiche sono stati identificati12,13 senza chiara comprensione dei loro ruoli biologici e interdipendenza. Inoltre, ci sono un numero ancora maggiore di modelli possibili combinatoriale di questi istoni e modificazioni del DNA, e non questi modelli combinatoriali – modifiche non individuali – che dettano epigenetici stati14. Quindi, c’è urgente bisogno di identificare le alterazioni in questi stati di cromatina durante la progressione del cancro o le risposte alla terapia. Conoscenza completa dell’epigenoma alterazioni nei cancri ha stato in ritardo in parte a causa di tecniche (ad esempio la generazione di dati su larga scala da piccole quantità di cliniche materiale/singole cellule) e analitiche (ad es. algoritmi per definire sfide di combinatoria Stati). Di conseguenza, c’è esigenza critica di metodi robusti ad alta produttività per la profilatura di gran numero di segni di modifiche dell’istone da materiale clinico e facile da implementare approcci computazionali per predire i modelli combinatoriale che faciliterà determinazione degli Stati epigenetici associato a diversi stadi di tumorigenesis e resistenza terapeutica. Ulteriori, dati disponibili dal recente epigenome profilatura studi15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in tessuti normali e linee cellulari può essere integrata con i profili di cromatina dei tumori per ulteriori approfondimenti su epigenome contributo alla biologia del tumore.
Profilatura di cromatina è diventato un potente strumento per identificare i modelli di associazione globale di vari cromatina modifiche15,24. Negli ultimi anni, ChIP-seq è diventato il “gold standard” per lo studio delle interazioni DNA-proteina su una scala globale25,26,27. Per ogni esperimento ChIP-seq, ci sono passaggi critici necessari per il suo successo, tra cui la dissociazione e la lavorazione del tessuto, determinare condizioni ottimale sonicazione, determinare la concentrazione di anticorpi ottimale per precipitazione, preparazione di biblioteca, Post-sequenziamento di elaborazione dei dati e dell’analisi a valle. Ognuno di questi passaggi contengono i punti di controllo chiave di controllo di qualità e quando presi insieme, sono cruciale per l’identificazione di potenziali bersagli per validazione funzionale correttamente. Attraverso l’innovazione in questi passaggi, parecchi studi precedenti hanno sviluppato metodologie per eseguire ChIP o ChIP-Seq da piccole quantità di tessuti28,29,30,31,32 . Inoltre, alcuni studi hanno suggerito protocolli per esperimenti di ChIP di alto-rendimento seguiti da PCR basati quantificazione33,34. Infine, alcune piattaforme di analisi disponibili pubblicamente per ChIP-Seq dati sono ora disponibili come Easeq35 e36di Galaxy. Tuttavia, è mancata una piattaforma integrata per l’esecuzione di ChIP-Seq in una moda di alto-rendimento in combinazione con una pipeline di calcolo per eseguire singolo marchio, come pure analisi dello stato della cromatina.
Questo protocollo descrive un workflow di ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in tessuti tumorali e linee cellulari, con facile seguire le linee guida che comprende tutti i passaggi necessari per un esperimento riuscito. Adottando un metodo di alto-rendimento precedentemente descritto da Blecher-Gonen et al. 37, questo protocollo può essere eseguito su decine di campioni in parallelo ed è stato applicato con successo su linee cellulari del cancro e tumori umani quali il melanoma, colon, prostata e glioblastoma multiforme. Dimostriamo la metodologia per sei modifiche dell’istone di nucleo che rappresentano componenti chiave del panorama normativo epigenetico in linee cellulari di melanoma umano e campioni di tumore. Queste modifiche includono H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione) e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Questi segni utilizzabile da solo o in combinazione per identificare stati di cromatina funzionalmente distinte che rappresentano i domini sia repressivi e attivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un modulo di ChIP-seq di alto-rendimento completo ed esaustivo per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in linee cellulari e tessuti del tumore umano. In qualsiasi protocollo di ChIP-seq, uno dei passi più importanti è la specificità dell’anticorpo. Qui, questo metodo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per le modifiche dell’istone sei descritta, i quali sono ChIP-grado e sono stati già convalidati nel nostro ed altri laboratori42,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Marcus Coyle, Curtis Gumbs, core SMF a MDACC per il supporto di sequenziamento. Il lavoro descritto in questo articolo è stato sostenuto da sovvenzioni dalla concessione NIH (CA016672) al nucleo di SMF e NCI awards (1K99CA160578 e R00CA160578) a K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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