En integrerad plattform för Genome-wide mappning av kromatin stater med hög genomströmning ChIP-sekvensering i tumörvävnad
Summary
Här beskriver vi en optimerad hög genomströmning ChIP-sekvensering protokoll och computational analyser pipeline för bestämning av genome-wide kromatin staten mönster från fryst tumörvävnad och cellinjer.
Abstract
Histon ändringar utgör en viktig del av epigenomet och spelar en viktig reglerande roll i fastställande av transkriptionell status för associerade loci. Dessutom har förekomsten av särskilda modifikationer använts för att bestämma position och identitet icke-kodande funktionselement som smakförstärkare. Under de senaste åren har kromatin immunoprecipitation följt av nästa generations sekvensering (ChIP-seq) blivit ett kraftfullt verktyg vid fastställandet av genome-wide profiler för enskilda Histon ändringar. Det har dock blivit allt tydligare att den kombinatoriska mönstren av kromatin modifieringar, kromatin stater, fastställa identitet och karaktär det associera genomisk locus. Därför arbetsflöden som består av stabila hög genomströmning (HT) metoder för profilering ett antal Histon modifiering märken, liksom computational analyser rörledningar kan hantera myriader av ChIP-Seq profilering datamängder, behövs för omfattande bestämning av epigenetisk staterna i stort antal prover. Den HT-ChIP-Seq arbetsflöde presenteras här består av två moduler: 1) ett experimentellt protokoll för profilering flera Histon ändringar från små mängder tumörprover och cellinjer i en 96-väl format; och 2) en computational data analys pipeline som kombinerar befintliga verktyg för att beräkna både enskilt varumärke beläggning och kombinatoriska kromatin staten mönster. Tillsammans underlättar dessa två moduler lätt bearbetning av hundratals ChIP-Seq prover på ett snabbt och effektivt sätt. Arbetsflödet presenteras här används för att härleda kromatin staten mönster från 6 Histon mark profiler i melanom tumörer och cellinjer. Sammantaget presenterar vi ett omfattande ChIP-seq-arbetsflöde som kan tillämpas på dussintals människors tumörprover och cancer cellinjer att bestämma epigenetisk avvikelser i olika maligniteter.
Introduction
Flesta däggdjur genomen (98-99%) består av icke-kodande sekvens, och dessa nocoding regioner innehåller reglerande element känt att delta i kontrollen av genuttryck och kromatin organisation1,2. I en normal cell är specifika montering av genomisk DNA i komprimerade kromatinstruktur avgörande för rumslig organisation, reglering och exakt timing av olika DNA-associerade processer3,4,5. I en cancercell dock kan kromatin modifieringar av avvikande epigenetiska mekanismer leda till felaktig organisation av kromatinstruktur, inklusive tillgång till föreskrivande element, kromosomala looping system och gen uttryck mönster6, 7,8,9,10.
Trots senaste framsteg, har vi begränsad förståelse av epigenetiska förändringar som är associerade med tumör progression eller terapeutiskt svar. Epigenomet består av en rad ändringar, inklusive Histon märken och DNA-metylering, som tillsammans bildar ett dynamiskt tillstånd (kallad kromatin staten) som inkräktar på gen uttryck nätverk och andra processer som är kritiska för att upprätthålla cellulära identitet. Förändringar i förstärkare har nyligen visats i flera maligniteter genom att studera H3K27Ac profiler11. Även om sådana studier ger insikt om sambandet mellan isolerade epigenetiska varumärken, mer än 100 epigenetiska förändringar har varit identifierade12,13 utan tydlig förståelse av deras biologiska roller och ömsesidigt beroende. Dessutom finns ett ännu större antal möjliga kombinatoriska mönster av dessa Histon och DNA ändringar, och det är dessa kombinatoriska mönster – inte enskilda ändringar – som dikterar epigenetiska staterna14. Därför finns det enorma behovet av att identifiera förändringar i dessa kromatin stater under cancer progression eller Svaren till terapi. Omfattande kunskap av epigenomet förändringar i cancer har halkat delvis på grund av tekniska (t.ex. generationen av storskaliga data från liten mängd kliniska material/enstaka celler) och analytisk (e.g. algoritmer att definiera kombinatoriska staterna) utmaningar. Därför finns det kritiska behov av robusta hög genomströmning metoder för profilering stort antal Histon modifiering märken från kliniska material och lätt att implementera beräkningsvetenskapliga metoder att förutsäga kombinatoriska mönster som kommer att underlätta bestämning av epigenetiska stater associerade med olika stadier av uppkomst och terapeutiska motstånd. Ytterligare, data finns från senaste epigenomet profilering studier15,16,17,18,19,20,21, 22,23 i normal vävnad och cellinjer kan integreras med kromatin profiler av tumörer för ytterligare insikter epigenomet bidrag till tumörbiologi.
Kromatin profilering har blivit ett kraftfullt verktyg för att identifiera de globala bindande mönster av olika kromatin ändringar15,24. Under de senaste åren har ChIP-seq blivit den ”gyllene standarden” för att studera DNA-protein interaktioner på en global skala25,26,27. För någon ChIP-seq experiment finns det kritiska steg krävs för dess framgång, inklusive vävnad behandling och avståndstagande, fastställelser optimal ultraljudsbehandling villkor, fastställelser optimal antikroppskoncentration för nederbörd, bibliotek förberedelse, efter sekvensering databehandling och efterföljande analys. Dessa steg innehåller viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter, och tillsammans, är avgörande för att korrekt identifiera potentiella mål för funktionella validering. Genom innovation i stegen, har flera tidigare studier utvecklat metoder för att utföra ChIP eller ChIP-Seq från liten mängd vävnader28,29,30,31,32 . Vidare tyder vissa studier protokoll för hög genomströmning ChIP experiment följt av PCR baserat kvantitering33,34. Slutligen finns nu vissa offentligt tillgängliga analys plattformar för ChIP-Seq data såsom Easeq35 och Galaxy36. En integrerad plattform för att utföra ChIP-Seq i en hög genomströmning mode i kombination med en computational pipeline att utföra enda varumärke samt kromatin staten analyser har dock saknats.
Det här protokollet beskriver ett komplett och omfattande ChIP-seq arbetsflöde för genome-wide mappning av kromatin staterna i tumörvävnad och cellinjer, med lätt för att följa riktlinjer som omfattar alla steg som krävs för ett lyckat experiment. Genom att anta en hög genomströmning metod tidigare beskrivits av Blecher-Gonen o.a. 37, detta protokoll kan utföras på dussintals prover parallellt och har tillämpats på cancer cellinjer och mänskliga tumörer såsom melanom, kolon, prostata och glioblastoma multiforme. Vi visar metoden för sex core Histon ändringar som representerar viktiga komponenter av epigenetiska reglerande landskap i mänskliga melanom cell linjer och tumörprover. Dessa ändringar inkluderar H3K27ac (smakförstärkare), H3K4me1 (aktiva och balanserande smakförstärkare), H3K4me3 (initiativtagare), H3K79me2 (transkriberas regioner), H3K27me3 (polycomb förtryck), och H3K9me3 (heterochromatic förtryck). Dessa märken kan användas antingen ensamt eller i kombination för att identifiera funktionellt distinkta kromatin stater som representerar både repressiva och aktiva domäner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en komplett och heltäckande hög genomströmning ChIP-seq modul för genome-wide mappning av kromatin staterna i mänsklig tumörvävnad och cellinjer. I ChIP-seq protokoll är en av de viktigaste stegen antikropp specificitet. Här, illustrerar denna metod immunoprecipitation villkor för beskrivs sex Histon ändringarna, varav alla är ChIP-grad och tidigare har validerats i våra och andra laboratorier42,44,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kärna på MDACC för sekvensering stöd. Det arbete som beskrivs i denna artikel stöddes av bidrag från NIH bidraget (CA016672) till SMF kärna och NCI awards (1K99CA160578 och R00CA160578) till K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
