Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano
Summary
Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.
Abstract
Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso – medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D’importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l’analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.
Introduction
Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia1, 2. gli sforzi per comprendere l’influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l’identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all’interno questi scomparti3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l’analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli5,6,7,8.
Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione9 per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa10, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori15,16 in estratti dell’acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione18. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione7,19 , 20. per meglio facilitare 16S robust…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, dottorato di ricerca per lo sviluppo del protocollo. Supporto globale per l’International materno pediatrica adolescenziale AIDS clinico prove gruppo (IMPAACT) è stato fornito dal National Institute of Allergy e Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) sotto numeri del premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), con il co-finanziamento il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) e l’Istituto nazionale di salute mentale (NIMH). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
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