Na Vivo Transferência de genes para o endotélio da artéria carótida comum de coelho

Summary

Este método é introduzir um transgene no endotélio de artérias carótidas de coelho. Introdução do transgene permite a avaliação da função biológica do produto do transgene em artérias normais ou modelos de doença. O método também é útil para medir a atividade de sequências reguladoras de DNA.

Abstract

O objetivo desse método é introduzir um transgene no endotélio de segmentos isolados de ambas as artérias carótidas comuns do coelho. O método alcança focal transgênese endotelial-seletivo, permitindo assim que um investigador para determinar as funções biológicas de transgenes endotelial-expresso e quantificar a actividade transcricional in vivo de sequências de DNA em grande artéria células endoteliais. O método usa isolamento cirúrgico das artérias carótidas comuns de coelho e uma arteriotomia para entregar um vetor viral do transgene-expressando no lúmen arterial. Um período de incubação curto do vetor no lúmen, com subsequente aspiração do conteúdo do lúmen, é suficiente para alcançar expressão eficiente e durável do transgene no endotélio, sem transdução detectável ou expressão fora da segmento arterial isolado. O método permite avaliação das atividades biológicas dos produtos do transgene em artérias normais e em modelos de doenças humanas e vascular, evitando efeitos sistêmicos que possam ser causados ou mediante a entrega do gene para outros sites (por exemplo. o fígado) ou pela abordagem alternativa de entregar o endotélio por germe linha transgênese construções genéticas. Aplicação do método é limitada pela necessidade de um cirurgião e anestesista, uma bem equipada sala de operações, os custos de aquisição e coelhos de habitação e a necessidade de experiência em construção de vetor de transferência de genes e uso. Resultados obtidos com este método incluem: transgene relacionadas a alterações na estrutura arterial, celularidade, matriz extracelular ou função vasomotora; aumentos ou reduções na inflamação arterial; alterações na apoptose celular vascular; e progressão, retardo ou regressão de doenças como a hiperplasia da íntima ou aterosclerose. O método também permite que a medição da capacidade nativas e sintéticas normativas de sequências de ADN para alterar a expressão do transgene em células endoteliais, fornecendo resultados que incluem: níveis de transgene mRNA, níveis de proteína do transgene e níveis de transgene atividade enzimática.

Introduction

O objetivo desse método é introduzir um transgene no endotélio das artérias carótidas comuns de coelho. Introdução do transgene permite a avaliação da função biológica do produto do transgene em artérias normais e em modelos de coelho de doença arterial humana. Superexpressão do transgene em modelos de doença pode revelar se o transgene (e seu produto proteico) mostram a promessa como agentes terapêuticos^1,2,3,4. Inclusão de elementos reguladores de cis-agindo na gaveta do transgene expressão permite a avaliação da actividade destes elementos no endotélio arterial na vivo^5,6. Conhecimento da atividade de elementos reguladores de cis-agindo de forma específicas pode ser usado para projetar cassettes de expressão mais ativo e para sondar os mecanismos de regulação gênica em grande artéria endotélio na vivo⁷.

Os coelhos são um modelo valioso para vários aspectos da fisiologia humana vascular e doença. Coelhos partilham muitas das características vasculares com seres humanos. Por exemplo, valores hematológicos basais, regulamento hemostático e tensão longitudinal vascular são semelhantes entre os coelhos e os humanos⁸. Modelos de coelho de doenças vasculares replicam características-chave de muitas doenças humanas, incluindo: aneurismas (semelhante geométricas e características de fluxo)⁹, vasoespasmo (resposta semelhante ao tratamento endovascular)^10,11, e aterosclerose (placas da íntima com características semelhantes, incluindo um núcleo rico em células de músculo liso, macrófagos e lipídios em uma tampa fibrosa)^12,13. Nesse sentido, foram desenvolvidos modelos de coelho para muitas doenças vasculares, como trombose, vasoespasmo, aneurisma, estenose de enxerto vascular, diabetes e aterosclerose^{8,13,14, 15,16}.

Para os investigadores a escolher entre os modelos animais de Fisiologia vascular e doença, o coelho tem várias vantagens. Em comparação com roedores, os maiores navios de coelhos permitam fácil manipulação cirúrgica, uso de dispositivos endovasculares e uma maior quantidade de tecido para medições quantitativas. Coelhos são muito mais próximos filogeneticamente primatas que são roedores¹⁷, e a maior diversidade genética de coelhos outbreds melhor se aproxima da variabilidade genética dos seres humanos. Diversidade genética é particularmente importante para estudos pré-clínicos, que-por sua natureza-visam desenvolver terapias que podem ser aplicadas para a população humana geneticamente diversa. Como com muitas se não todas as outras espécies de modelo, genes do coelho são facilmente clonados ou sintetizados porque foi sequenciado o genoma de coelho com cobertura alta (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Comparado a outros grandes modelos animais (tais como cães, porcos ou ovelhas), os coelhos são relativamente baratos comprar e casa e eles são mais fáceis de criar e manipular. Modelos específicos de doença vascular em coelhos cada tem suas próprias vantagens e deficiências como modelos de doenças humanas que estão além do escopo deste manuscrito^8,12,18. Um investigador deve rever essas vantagens e deficiências para determinar se o coelho é o melhor modelo para responder a uma pergunta específica e experimental.

Introdução de sequências regulamentar de Ácido desoxirribonucleico (DNA) em células endoteliais na vivo permite a investigação da actividade destas sequências em um ambiente fisiológico complexo. Estudos in vitro em células endoteliais transfectadas podem ser útil para a avaliação inicial de sequências reguladoras de DNA; no entanto, os níveis de expressão em cultura de tecidos modelos às vezes não são reproduzidos quando os estudos são repetidos na vivo^19,5,20. Sistemas in vitro também podem ser útil para explorar caminhos básicos de proteínas de sinalização e fisiologia endotelial, bem como comunicação entre culturas de células vasculares; no entanto, caminhos mais complexos ou redes reguladoras que são influenciadas pelas populações complexas de células vasculares vizinhas ou o sistema imunológico são mais bem estudadas na vivo sistema^6,20. O método descrito aqui fornece uma plataforma para explorar a regulação da expressão do transgene no endotélio dentro do contexto de uma nave intacta, com ou sem doença. O sistema in vivo também permite investigação do crosstalk celular fisiológico e patológico e a identificação das contribuições do sistema imunológico para regulamento de gene expressão⁶.

Transgênese germinal (especialmente em ratos) é uma abordagem alternativa para dirigir a expressão do transgene para células endoteliais. Esta abordagem pode fornecer a expressão do transgene ao longo da vida, com direcionamento endotelial mediada pelo promotor específico ou regiões reguladoras^21,22. No entanto, a geração de ratos transgénicos é demorado e caro, várias linhas de transgênicas devem ser frequentemente testadas para garantir direcionamento do transgene para o tipo de célula desejada e a conquista de níveis de expressão do transgene adequada e experimental resultados em sistemas de murino podem ser dependente da tensão. Murino modelos transgénicos com transgenes endotelial-alvo têm muitas vantagens: não há necessidade de realizar a cirurgia em cada animal experimental a fim de alcançar a transgênese, ratos experimentais podem ser criados com numerosos outros ratos transgênicos disponíveis no a fim de testar interações genéticas e fenotípicas, e há uma grande variedade de anticorpos que reagem com proteínas murino, facilitando a caracterização de fenótipos. No entanto, direcionamento de transgenes para o endotélio através da linha de germe normalmente resulta na expressão do transgene em todo o sistema vascular,²² , tornando-se difícil determinar o local em que o produto do transgene está agindo. Isto é especialmente verdadeiro quando o produto do transgene é secretado, porque um transgene produto secretado pelas células endoteliais em todo o sistema vascular pode ter atividade biológica em qualquer número de sites dentro de um animal. Embora o método descrito neste manuscrito requer conhecimento técnico e instalações especializadas, pode ser menos demorado e menos caro do que desenvolver uma linha de rato transgénico endoteliais específicas. Permite a avaliação da função de uma proteína seletivamente nas células endoteliais de um segmento de grande artéria, e que permite o uso da carótida contralateral comum como um controle pareado (eliminando os fatores sistêmicos que podem variar entre experimental animais-por exemplo, a pressão arterial ou os níveis de colesterol-como variáveis não controladas).

Terapia gênica é uma abordagem promissora para o tratamento das doenças vasculares, doenças crônicas particularmente, porque um único aplicativo pode fornecer sustentada ou possivelmente ao longo da vida a expressão de um gene terapêutico²³. A promessa terapêutica da terapia genética tem sido explorada em modelos animais de transferência de genes somáticos, muitas vezes direcionando o fígado^24,,²⁵, que é um alvo relativamente fácil, porque muitos vetores virais transmitidas pelo sangue são hepatotropic. No entanto, para ter efeito na doença vascular, terapia genética direcionada para o fígado deve alcançar sistêmica superexpressão de proteínas. Isso normalmente requer grandes doses de vetor, que pode ser tóxico ou mesmo fatal²⁶. Além disso, aumentou os níveis sistêmicos de um aumento de proteínas, o risco de efeitos secundários fora do alvo, o que pode complicar ou mesmo obscurecer a interpretação dos resultados experimentais. Terapia de gene locais visando o endotélio vascular, conforme descrito neste manuscrito poderia evitar efeitos secundários sistêmicos porque o vetor infundido não é amplamente divulgado além do segmento arterial transduzido e efeitos vasculares locais podem ser obtidos sem alterações nos níveis plasmáticos sistêmicos de proteína. ²⁷ -além disso, uma quantidade muito menor de vetor é necessária para transduce um segmento arterial do que é necessário para alcançar a transdução hepática robusta. Expressão do transgene do fígado relatou a diminuir ao longo do tempo, provavelmente devido a renovação celular, que exigem dosagem repetida se expressão do transgene de alto nível é para ser mantida. ²⁸ em contraste, a baixa rotatividade do endotélio fornece expressão estável durante pelo menos 48 semanas em coelhos alimentados com comida e pelo menos 24 semanas em lesões ateroscleróticas de coelhos alimentados com colesterol. ^{1 , 27}

Para determinar se este método de transferência de genes de endotélio de carótida comum coelho é apropriado, as vantagens e desvantagens (tabela 1) devem ser consideradas no contexto dos objetivos específicos de investigação. As vantagens deste método incluem: outbreds coelhos são melhor representante da diversidade genética humana do que são puras ratos (importantes para trabalhos pré-clínicos); coelhos de fornecer maiores navios para manipulação mais fácil e mais tecido para análise; o método pode atingir a expressão do transgene endotélio-alvo muito mais rapidamente do que o germe-linha endotelial de direcionamento em ratos transgénicos; dose de vetor pode ser facilmente ajustada aos níveis variáveis de modelo da expressão do transgene; processos específicos de grande artéria endotélio podem ser investigados; e transgênese vascular local permite a carótida oposta no mesmo animal para ser usado como um controle, eliminando fatores sistêmicos como variáveis não controladas. As desvantagens incluem: instalações especiais e conhecimentos são necessários; menos fundos geneticamente modificados no qual a experiência estão disponíveis em coelhos do que em ratos; e há uma menos extensa seleção de anticorpos de coelho contra proteínas do mouse (para immunodetection de proteína do transgene e outros antígenos que podem ser importantes na interpretação de resultados experimentais).

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Washington escritório de bem-estar Animal e associado institucional Cuidado Animal e Comitê de uso (IACUC) e foram concluídos em conformidade e em conformidade com todos os relevante regulamentar e institucional diretrizes. Nota: A transferência de genes para as artérias carótidas comuns coelho é executada em coelhos por um cirurgião com o auxílio de um anestesista ou assistente. 1. transferência de Gene para as artérias carótid…

Representative Results

Para implementar esse método com confiança, experimentos preliminares são necessários para estabelecer que o operador realize transferência de genes eficiente e reprodutíveis, com expressão do transgene principalmente em células endoteliais luminal. Em nossa experiência, isto é mais facilmente avaliado utilizando um vetor que expressa a β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) dos segmentos de carótida comuns coloração removido 3 dias após …

Discussion

Certos aspectos da técnica cirúrgica merecem particular atenção. Exposição completa e mobilização da artéria carótida comum através de dissecção cuidadosa vai facilitar a transferência e arteriotomia reparação de gene. No entanto, durante a dissecção, manipulação direta da artéria carótida deve ser minimizada para evitar o vasoespasmo. Além disso, qualquer sangramento adjacente à artéria deve ser interrompida, aplicando uma ligeira pressão com gaze e sangue extravasado deve ser limpa imediatamen…

Materials

Disposables
3mL syringe with 24G needle	Becton Dickinson	309571	2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle	Becton Dickinson	309623	6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock	Nipro Medical Corp	JD+20L
Catheters, 24G x 3/4"	Terumo Medical Products	SROX2419V
19G needle	Becton Dickinson	305187	Gene transfer surgery only
21G needle	Becton Dickinson	305165	For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4"	Dynarex	3242	~10-15 per surgery
3-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-244
5-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-182	Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture	CP Medical	8648P	Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	421A	Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	398A	Gene transfer surgery only
Alcohol swabs	Covidien Ltd.	6818	For placement of I.V. line
Catheter plug	Vetoquinol	411498	Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.	05098916106
Xylazine, 100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
Lidocaine HCl, 2%	Pfizer	00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5%	Pfizer	00409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705	Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride	Baxter	2B1309	2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2	Gene transfer surgery only
Isoflurane	Multiple vendors	Catalog number not available
Gene transfer vector			Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight	Roboz	RS-7900	Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt	Roboz	RS-6828
Needle holder /w suture scissors	Miltex	8-14-IMC	Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors	Roboz	RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock	Roboz	RS-6412	Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt	Roboz	RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs	Roboz	RS-6514	2x
Backhaus towel clamp 3.5"	Roboz		4x
Micro clip setting forceps 4.75"	Roboz	RS-6496	Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm	Roboz		2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width	Roboz	RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm	Roboz	RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip	Roboz	RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips	Roboz	RS-7110	2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips	Roboz	RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips	Roboz	RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips	Roboz	RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width	Roboz	RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width	Fine Science Tools	11092-12	2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight	Fine Science Tools	11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump	Multiple vendors	Catalog number not available
Forced air warming unit	3M	Bair Hugger Model 505	Gene transfer surgery only
IV infusion pump	Heska	Vet IV 2.2	Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger	Multiple vendors	Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor	Surgivet	Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit	MACAN Manufacturing	MV-9
Surgical microscope	D.F. Vasconcellos	M900	Needs ~16x magnification