Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter
Summary
Topi rappresentano un modello prezioso in vivo per studiare l’infezione e malattie causate da microrganismi gastrointestinale. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per studiare la colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici in modelli murini di Helicobacter pylori-malattia correlata.
Abstract
Helicobacter pylori è un agente patogeno gastrico che è presente a metà della popolazione mondiale ed è una causa significativa della morbosità e della mortalità negli esseri umani. Diversi modelli di mouse dell’infezione gastrica Helicobacter sono stati sviluppati per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari per cui H. pylori batteri colonizzano lo stomaco degli umani e causare la malattia. Qui, descriviamo i protocolli per: 1) preparare sospensioni batteriche per l’infezione in vivo dei topi tramite sonda gastrica intragastrica; 2) determinare i livelli di colonizzazione batterica in tessuti gastrici del mouse, da reazione a catena della polimerasi (PCR) e contando praticabile; e 3) valutare le alterazioni patologiche, dall’istologia. Per stabilire la Helicobactinfezione nei topi, animali (SPF) esenti da patogeni specifici prima vengono inoculati con sospensioni (contenenti ≥ 105 unità formanti colonie, CFUs) di mouse-colonizzazione di ceppi di entrambi i pilori di Helicobacter o altre speci di Helicobacter gastrico da animali, come Helicobacter felis. Presso post-l’infezione tempo-punti appropriati, stomaci sono asportati e dissecati sagittally in due frammenti di tessuto uguale, ciascuno costituito da regioni antrum e corpo. Uno di questi frammenti viene quindi utilizzato per conteggio praticabile o estrazione del DNA, mentre l’altro è sottoposto a elaborazione istologica. Colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici nello stomaco possono essere valutati ordinariamente in sezioni di tessuto gastrico macchiate con macchie Warthin-Stellato, Giemsa o Haematoxylin ed eosina (H & E), come appropriato. Analisi immunologiche supplementari possono essere effettuati anche da immunohistochemistry o immunofluorescenza su sezioni di tessuto gastrico di topo. I protocolli descritti di seguito sono progettati specificamente per consentire la valutazione nei topi di patologie gastriche che assomigliano a quelli in umani relativi pilori del H. malattie, compreso infiammazione, atrofia della ghiandola e formazione follicolo linfoide. La preparazione dell’inoculo e protocolli intragastrico “gavage” possono anche essere adattati per studiare la patogenesi di altri patogeni enterici umani che colonizzano i topi, come Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori è un patogeno gastrico a forma di spirale, gram-negativo, umano presente in tutte le popolazioni in tutto il mondo, con tassi di infezione nei paesi in via di sviluppo stimati nell’ordine di 80%1. Anche se la maggior parte dei pilori del H.-individui infetti sono asintomatici, alcuni sviluppano malattie più gravi, che vanno dall’ulcerazione peptica a cancro gastrico2. H. pylori-tumori associati ampiamente sono caratterizzati da cambiamenti maligni in cellule epiteliali (GECs) o dalla formazione di tessuti linfoidi supplementare-nodale nello stomaco, risultante nell’adenocarcinoma gastrico o mucosa-collegato linfoide linfoma del tessuto (malto), rispettivamente. H. pylori è altamente adattato per sopravvivere nella nicchia ecologica dura dello stomaco dovuto alla presenza di vari fattori di virulenza e meccanismi che agevolino la sua adesione, la crescita e il metabolismo in questa nicchia. In particolare, i ceppi virulenti di H. pylori possiedono il 40 kb cag isola di patogenicità (cagPAI) che codifica circa 30 geni richiesti per la produzione di una tipo 4 secrezione sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivi sforzi dei pilori del H. sono associati con l’induzione dei livelli elevati di infiammazione cronica nell’ospite, che è stato implicato come un precursore essenziale di adenocarcinoma gastrico5.
In vivo modelli animali, soprattutto topi, sono state altamente informativi, consentendo ai ricercatori di studiare i contributi relativi di host, fattori ambientali e batterici su infezione da H. pylori e malattia risultato6. Gli studi hanno dimostrato in precedenza che prolungato di H. pylori infezione dei topi sui risultati C57BL/6 background genetico nello sviluppo della gastrite cronica e la ghiandola atrofia, entrambi tratti distintivi di H. pylori infezione7. Inoltre, l’infezione con la specie affini batterica felino/canino, H. felis, ha dimostrato di indurre la formazione di malto in topi con simile patologia e progressione di malattia come visto in umano MALT linfoma8,9. Il più comunemente usato H. pylori isolato negli studi di colonizzazione del mouse è il “Sydney sforzo 1” (SS1) ceppo10, che è cagPAI+ , ma ha un non-funzionale T4SS (T4SS−)11. Altri ceppi ampiamente usati includono H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Per infezioni da H. felis , il ceppo CS1 (“gatto a spirale 1”, cagPAI–/T4SS−) è generalmente usato14.
Qui, forniamo un protocollo che descrive la preparazione di Helicobacter inoculi per l’infezione in vivo , la procedura per sonda gastrica intragastrica di topi, nonché metodi per la lavorazione dei tessuti per lo studio dei cambiamenti istopatologici nello stomaco. In particolare, questo articolo si concentrerà sui metodi istologici utilizzati per visualizzare la colonizzazione batterica e valutare i cambiamenti istopatologici, compreso formazione di malto, nella mucosa gastrica dei topi infettati. Alcuni dei metodi descritti qui può essere adattato allo studio di altri agenti patogeni dell’intestino quali S. Typhimurium o rodentium c..
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’uso di un modello di topo in vivo per l’infezione di Helicobacter . I punti critici della procedura sono la: 1) preparazione di Helicobacter inoculi contenenti batteri vitali e mobili; 2) consegna dei numeri appropriati di batteri al mouse tramite sonda gastrica intragastrica; 3) rilevamento delle infezioni batteriche da Colonia contando e/o PCR; e 4) elaborazione dei tessuti gastrici per consentire la valutazione della istopatologia in infettato gli stomaci. Ulteri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare la sig. ra r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann per assistenza tecnica. Gli autori riconoscono l’uso dei servizi e l’assistenza tecnica della piattaforma di istologia di Monash, dipartimento di anatomia e biologia inerente allo sviluppo, Monash University. Il laboratorio è sostenuto da finanziamenti del National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per RLF (APP1079930, APP1107930). RLF è supportato da un Senior Research Fellowship da NHMRC (APP1079904). KD e MC sono entrambi supportati da Monash laurea Borse di studio. KD è supportato anche dal centro per l’immunità innata e contagiosa malattie, Hudson Institute of Medical Research, mentre MC ha una borsa di studio post-laurea internazionale dalla facoltà di medicina, infermieristica e scienze di salute, Università di Monash. Ricerca presso l’Hudson Institute of Medical Research è supportata dal programma di supporto dell’infrastruttura operativa del governo vittoriano.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
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