Musen modeller av Helicobacter infeksjon og mage patologi
Summary
Mus representerer en uvurderlig i vivo modell å studere infeksjoner og sykdommer forårsaket av gastrointestinal mikroorganismer. Her beskriver vi metoder brukt for å studere bakteriell kolonisering og histopathological endringer i musen modeller av Helicobacter pylori-relatert sykdom.
Abstract
Helicobacter pylori er en mage patogen som finnes i halvparten av den globale befolkningen og er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet hos mennesker. Flere musen modeller av mage Helicobacter infeksjon er utviklet for å studere molekylære og cellulære mekanismer der H. pylori bakterien kolonisere magen av menneskelige verter og forårsake sykdom. Her beskriver vi protokoller til: 1) forberede bakteriell suspensjoner i vivo infeksjon av mus via intragastric gavage; 2) bestemme bakteriell kolonisering nivåer i musen mage vev, av polymerasekjedereaksjons (PCR) og levedyktig teller; og 3) vurdere patologiske forandringer, ved histology. For å etablere Helicobacteh infeksjon i mus, bestemte patogen-fri (SPF) dyrene er først inokulert med suspensjoner (inneholder ≥105 colony-forming enheter, CFUs) av mus-kolonisere stammer av enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som Helicobacter felis. På riktig tidspunkt etter infeksjon, mager forbrukeravgift og dissekert sagittally i to like vev fragmenter, hver bestående av regionene antrum og kroppen. En av disse fragmentene brukes deretter for levedyktig teller eller DNA utvinning, mens den andre er utsatt for histologiske behandling. Bakteriell kolonisering og histopathological endringer i magen kan vurderes rutinemessig i mage vev delene med Warthin-stjernehimmelen, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) flekker, etter behov. Ekstra immunologiske analyser kan også gjennomføres av immunohistochemistry eller immunofluorescence på musen mage vev deler. Protokollene beskrevet nedenfor er spesielt designet for å aktivere vurdering i mus mage patologi som ligner de i menneske-relaterte H. pylori sykdommer, inkludert betennelse, kjertel atrofi og lymfoide hårsekken formasjon. Inoculum forberedelse og intragastric gavage protokoller kan også tilpasses til å studere patogenesen av andre enteric human patogener som koloniser mus, for eksempel Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori er en spiral-formet, Gram-negative, menneskelige mage patogen i alle befolkninger over hele verden, med infeksjon priser i utviklingsland anslått til i 80%1. Selv om de fleste H. pylori-infiserte individer er asymptomatisk, noen utvikler mer alvorlige sykdommer, mellom magesår magekreft2. H. pylori-tilknyttede kreft er generelt preget ved ondartet endringer i epitelceller (GECs) eller dannelsen av ekstra knutepunktet lymfoid vev i magen, resulterer i mage adenocarcinoma eller mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er svært tilpasset for å overleve i den harde nisje i magen av ulike virulens faktorer og mekanismer tilrettelegge sin tilslutning, vekst og metabolisme i denne nisje. Spesielt har virulente stammer av H. pylori 40 kb cag virusets Island (cagPAI) som koder ca 30 gener kreves for produksjonen av en Type 4 sekresjon system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induksjon av høyere nivåer av kronisk betennelse i verten, som har vært innblandet som en viktig forløper mage adenocarcinoma5.
I vivo dyr modeller, spesielt mus, har vært svært informativ ved å tillate forskere å undersøke den relative bidrag av verten, bakteriell og miljømessige faktorer på H. pylori infeksjon og sykdom resultatet6. Studier har tidligere vist som langvarig H. pylori infeksjon av mus på C57BL/6 genetisk bakgrunn resultatene i utviklingen av kronisk gastritt og kjertel atrofi, begge kjennetegnene av H. pylori infeksjon7. Videre har smitte med relaterte feline/hjørnetann bakteriell arter, H. felis, blitt vist å skape MALT i mus med lignende patologi og sykdomsprogresjon sett i menneskelig MALT lymfom8,9. De mest brukte H. pylori isolere i musen kolonisering studier er “Sydney belastningen 1” (SS1) belastning10, som er cagPAI+ men har en ikke-fungerende T4SS (T4SS−)11. Andre brukte stammer inkluderer H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. For H. felis infeksjoner, belastningen CS1 (“Cat Spiral 1” cagPAI–/T4SS−) er normalt brukt14.
Her gir vi en protokoll som beskriver utarbeidelse av Helicobacter inocula i vivo infisert, prosedyren for intragastric gavage av mus og metoder for behandling av vev for å studere histopathological endringer i magen. Spesielt vil denne artikkelen fokusere på histologiske metodene som brukes til å visualisere bakteriell kolonisering og vurdere histopathological endringer, inkludert MALT formasjon, i mage mucosa i infiserte mus. Noen av metodene som er beskrevet her kan tilpasses til studiet av andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av en i vivo musemodell for Helicobacter infeksjon. Kritisk trinnene av fremgangsmåten er den: 1) utarbeidelse av Helicobacter inocula som inneholder levedyktig og motile bakterier; 2) levering av passende antallet bakterier til musen via intragastric gavage; 3) oppdagelsen av bakteriell infeksjon av kolonien teller og/eller PCR; og 4) behandling av mage vev å aktivere vurdering av histopatologi i infisert mager. Ytterligere forslag til endringer, feilsøkin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk assistanse. Forfatterne erkjenner bruk av fasilitetene og teknisk assistanse av Monash Histology plattform, Institutt for anatomi og utviklingsbiologi, Monash University. Laboratoriet er støttet av finansiering fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF støttes av en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC støttes både av Monash Graduate stipender. KD er også støttet av Centre for medfødt immunitet og smittsomme sykdommer, Hudson Institute medisinsk forskning, mens MC har en internasjonal Postgraduate stipend fra fakultet, sykepleie og helsefag, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research støttes av den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtteprogrammet.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
