Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën
Summary
Muizen vertegenwoordigen een onschatbare waarde in vivo -model om te studeren van besmetting en ziekten veroorzaakt door gastro-intestinale micro-organismen. Hier beschrijven we de methoden gebruikt bij het bestuderen van bacteriële kolonisatie en histopathologische veranderingen in muismodellen van Helicobacter pylori-gerelateerde ziekte.
Abstract
Helicobacter pylori is een maag ziekteverwekker die aanwezig is in de helft van de wereldbevolking en is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij de mens. Verschillende Muismodellen van maag Helicobacter infectie zijn ontwikkeld om te bestuderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen waarbij H. pylori bacteriën koloniseren de maag van menselijke gastheren en ziekte veroorzaken. Hierin beschrijven we protocollen: 1) bacteriële schorsingen voorbereiden op de infectie in vivo van muizen via intragastric maagsonde; 2) bepalen bacteriële kolonisatie niveaus in muis maag weefsel, door de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en levensvatbare tellen; en 3) beoordelen pathologische veranderingen, door histologie. Om vast te stellen HelicobactTranslator infectie bij muizen, specifieke pathogenen vrije (SPF) dieren worden eerst geïnoculeerd met suspensies (met ≥105 kolonie-vormende eenheden, CFUs) van muis-koloniseren stammen van beide Helicobacter pylori of andere maag Helicobacter spp. van dieren, zoals Helicobacter felis. Op de juiste tijdstippen na infectie, zijn magen weggesneden en ontleed sagittally in twee gelijke weefsel fragmenten, elk bestaande uit het antrum en lichaam regio’s. Een van deze fragmenten wordt vervolgens gebruikt voor levensvatbare tellen of DNA-extractie, terwijl de andere histologische verwerking is onderworpen. Bacteriële kolonisatie en histopathologische veranderingen in de maag kunnen routinematig in maag weefselsecties gekleurd met Warthin-Starry Giemsa of Haematoxylin en eosine (H & E) vlekken, als passend worden beoordeeld. Extra immunologische analyses kunnen ook worden uitgevoerd door immunohistochemistry of immunofluorescentie op muis maag weefselsecties. De hieronder beschreven protocollen zijn speciaal ontworpen om de beoordeling in muizen van maag pathologieën die lijkt op die in de mens-gerelateerde H. pylori ziekten, waaronder ontstekingen, klier atrofie en lymfoïde follikel vorming. De bereiding van het entmateriaal en intragastric maagsonde protocollen kunnen ook worden aangepast aan het bestuderen van de pathogenese van andere zuurbestendige menselijke pathogenen die muizen, zoals Salmonella Typhimurium of Citrobacter rodentiumkoloniseren.
Introduction
Helicobacter pylori is een spiraal-vormige, gramnegatieve, menselijke maag pathogen aanwezig in alle bevolkingsgroepen over de hele wereld, met infectieniveaus in ontwikkelingslanden naar schatting in de orde van 80%1. Hoewel de meeste H. pylori-geïnfecteerde individuen zijn asymptomatisch, sommige meer ernstige ziekten, variërend van peptic ulceratie aan maagkanker2te ontwikkelen. H. pylori-geassocieerde kankers zijn over het algemeen gekenmerkt door kwaadaardige veranderingen in epitheliale cellen (GECs) of door de vorming van extra knooppunten lymfoïde weefsels in de maag, resulterend in maag adenocarcinoom of mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel (mout) lymfoom, respectievelijk. H. pylori is zeer geschikt om te overleven in de strenge ecologische niche van de maag als gevolg van de aanwezigheid van verschillende virulentiefactoren en mechanismen te vergemakkelijken zijn aanhankelijkheid, de groei en het metabolisme in deze niche. In het bijzonder bezitten virulente stammen van H. pylori de 40 kb cag pathogeniteit eiland (cagPAI) dat ongeveer 30 genen benodigd voor de productie van een Type 4 secretie systeem (T4SS)3,4 codeert . CAG PAI-positieve H. pylori -stammen zijn geassocieerd met de inductie van hogere niveaus van chronische ontsteking in de host, die als een essentiële voorloper van maag adenocarcinoom5heeft zijn betrokken.
In vivo diermodellen, vooral muizen, zijn zeer informatief geweest doordat onderzoekers te onderzoeken van de relatieve bijdragen van host, bacteriële en ecologische factoren op H. pylori infectie en ziekte resultaat6. Studies hebben eerder aangetoond dat langdurig H. pylori infectie van muizen op de resultaten van de C57BL/6-genetische achtergrond in de ontwikkeling van chronische gastritis en klier atrofie, beide kenmerken van H. pylori infectie7. Bovendien is besmetting met de verwante katachtige/canine bacteriesoorten, H. felis, gebleken voor het opwekken van mout vorming in muizen met soortgelijke pathologie en progressie van de ziekte zoals gezien in de menselijke MALT lymfoom-8,9. De meest gebruikte H. pylori isolaat in muis kolonisatie studies is de “Sydney stam 1” (SS1) stam10, dat is cagPAI+ , maar heeft een niet-functionele T4SS (T4SS−)11. Andere gebruikte stammen omvatten H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 en X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Voor H. felis infecties, de stam CS1 (‘kat spiraal 1″ cagPAI–/T4SS−) is over het algemeen gebruikte14.
Hierin bieden wij een protocol met een beschrijving van de voorbereiding van Helicobacter entmateriaal voor in vivo infectie, de procedure voor intragastric maagsonde van muizen, alsmede methoden voor de verwerking van weefsels voor de studie van histopathologische veranderingen in de maag. Met name dit artikel zal zich richten op de histologische methoden gebruikt voor het visualiseren van bacteriële kolonisatie en beoordelen van histopathologische veranderingen, met inbegrip van de vorming van de mout, in het maagslijmvlies van geïnfecteerde muizen. Sommige van de hier beschreven methoden kunnen worden aangepast aan de studie van andere darm-pathogenen zoals S. Typhimurium of C. rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van een in vivo muismodel voor Helicobacter infectie. De kritische stappen van de procedure zijn de: 1) voorbereiding van Helicobacter entmateriaal met levensvatbare en motile bacteriën; 2) levering van het juiste aantal bacteriën aan de muis via intragastric maagsonde; 3) detectie van bacteriële infectie door het tellen van de kolonie en/of PCR; en 4) verwerking van weefsels van de maag om de beoordeling van histopathologisch onderzoek in besmet magen. Ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank mevrouw A. De Paoli en Ms. Georgie Wray-McCann voor technische bijstand. De auteurs erkennen gebruik van de faciliteiten en technische bijstand van Monash histologie Platform, afdeling Anatomie en ontwikkelingsbiologie, Monash University. Het laboratorium wordt ondersteund door financiële middelen van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) naar RLF (APP1079930, APP1107930). RLF wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van de NHMRC (APP1079904). KD en MC worden beide ondersteund door Monash afgestudeerde beurzen. KD wordt ook ondersteund door het centrum voor aangeboren immuniteit en Infectious ziekten, Hudson Institute of Medical Research, terwijl MC een postdoctorale International-beurs van de faculteit geneeskunde, verpleegkunde en gezondheidswetenschappen, Monash University heeft. Onderzoek op de Hudson Institute of Medical Research wordt ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
