マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価
Summary
この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。
Abstract
マラリアは、原虫によって引き起こされる生命にかかわる病気、マラリア最もアフリカ大陸で流行しているとほとんどマラリア関連の死の責任世界的に。マラリアに感染した人々 の病気の進化に影響を与える組織、血管不全、および炎症性応答の寄生虫隔離を含むいくつかの要因。マラリアの感染赤血球 (内側) リリース小さな細胞小胞 (Ev) 寄生虫とホスト間の病態と細胞のコミュニケーションを仲介する貨物分子の種類を含みます。EVs は効率的に彼らが彼らの機能を調節する細胞によってとられます。ここで寄生虫ホストの相互作用における Ev の役割に対処するための戦略を議論します。まず、緑細胞リンカー染料を使用してラベリングおよび血管内皮細胞による EV 内面を追跡するために簡単なメソッドを説明します。第二に、蛍光に分類されたデキストランを使用して血管内皮細胞単層膜の透磁率を測定する簡単な方法を報告する.最後に、内皮細胞の機能に小さな非コード RNA 分子の役割を調査する方法を示します。
Introduction
世界保健機関によると 2015 年に世界的なマラリアの 2 億 1200 万の新しいケースもあったし、約 429,000 人が死亡、子供 5 歳未満年齢1の主に。血管機能障害と関連付けられる多くの場合、深刻な病気につながるメカニズムには、不明確な2が残っています。マラリア原虫感染は分泌細胞小胞 (Ev) として知られている小さい bi 脂質膜球です。知られているこれらの EVs が潜在的に関連する宿主の免疫応答、感染プロセスに感染。しかし、ほとんどはマラリア感染症3の間にこれらの小胞の正確な機能について知られています。彼らは 2 つの重要な役割を果たすことが可能です: 1 つの手を貢献するかもしれない病因活性化マクロファージ4,の5;その一方で、寄生虫および寄生虫とホスト6,7間通信調停をする可能性があります。実際には、寄生虫は、EVs を介してお互いの間蛋白質または核酸を転送できます。たとえば、トリパノソーマrhodesiense EVs 毒性因子 Serum Resistance-Associated (SRA) を転送することができます、他t. グリコシルホスファチジルイノシトールとホストの両方の赤血球8をターゲットすることができます。さらに、マラリア感染は、EVs 内で核酸を転送することによってお互いの間通信します。これにより最適化し、その成長を同期する寄生虫です。実際には、EVs がガメトサイト変換の主要なレギュレータをしてしたがって、伝送ステージ7の規則に貢献。
だけでなく、EVs は寄生虫を規制する、彼らはまた寄生虫ホストの相互作用を仲介します。最近、内側から Ev を含む宿主由来の Microrna (Mirna; 21-25 のヌクレオチド9の範囲で小さな RNA 種) ひと内皮細胞によってとられたことを発見しました。EVs の miRNAs 形成 Ago2 と複雑な安定 (メンバーによる RNA サイレンシングの複雑な)、受信者のセルに届けた後は特にサイレンシング遺伝子発現、細胞10のバリヤ特性に影響を与えることができます。標準的なプロトコルは、EVs の機能を調査するために開発されています。ここでは、我々 はまず受信者細胞による吸収を調査する EVs の蛍光ラベリングを可能にするプロトコルをについて説明します。さらに、共焦点の顕微鏡を使用して、セル内の EV の運命を追跡することが可能です。いくつかの蛍光染料は、EVs を追跡する使用ことができます。アミン反応性色素、5-(and-6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) と小胞内カルセイン AM になる蛍光を一度。明るくより均一な信号を与えるので PKH、両親媒性ラベルを使うことが望ましい。このアプローチは、EVs と受信者の細胞間の相互作用を理解するための重要な情報を提供します。一方、いくつかのケースで EVs は細胞の表面に結合、いくつかの小胞急速にとられる。取り込み時に EVs は、出す規制機能の細胞に彼らの貨物を提供します。
ここでは、細胞膜を通して蛍光デキストランの転送を定量化することで培養内皮細胞のバリア機能を測定するためのプロトコルについて述べる。敏感なトレーサーは放射性標識マーカーなど使用できます。ただし、使用するため特別な安全上の注意が必要です。他のアッセイは、内皮下電気抵抗 (TEER) タイト結合の整合性を測定するなどの in vitroバリア機能を測定する存在します。最終的に蛍光抗体法で ZO-1、タイト結合蛋白を可視化によりよく10としてタイト結合の整合性の評価ができます。EVs は規制の潜在的な特性を持ついくつかの貨物を含む複雑な異種のエンティティであるので、レシピエントの細胞への影響を研究する特定の RNA をノザンに便利です。したがって、利息10の miRNA を表現する安定したセルラインを生成することを目的とするプロトコルを定義するもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
トキソ プラズマ、トリパノソーマ、リーシュ マニア、トリコモナスを含むいくつかの寄生虫が感染させた宿主細胞によって電気自動車のリリースをトリガーします。、病原体によってリリースされた EVs は宿主の免疫応答を調節したり寄生虫6間の携帯電話の通信を仲介します。まだ、これらの小胞がマラリア病に貢献する方法を示唆する少し証拠があります。ここでは、<e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究が、ノバルティス財団医療 – と (ピム) 生物学研究、ゴットフリートとジュリア ・ バンガーター ・ Rhyner 財団 (MW、ピムと) と (ピム) にフリブール大学の研究プールによって財政上支えられる部分で。追加の助成金 (KAB SM し) 外国の学者のスイス政府優秀奨学金があります。テクニカル サポート、イザベルの Fellay と Solange Kharoubi ヘスに感謝します。
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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