Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária
Summary
Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.
Abstract
A malária é uma doença fatal causada por parasitas Plasmodium , por p. falciparum sendo a mais prevalente no continente africano e responsável pela maioria das mortes relacionadas com a malária globalmente. Vários fatores, incluindo a fixação do parasita em tecidos, disfunção vascular e respostas inflamatórias influenciam a evolução da doença em pessoas infectadas por malária. Por p. falciparum-glóbulos vermelhos infectados (iRBCs) liberar pequenas vesículas extracelulares (EVs) contendo diferentes tipos de moléculas de carga que medeiam a comunicação celular e patogênese entre parasita e hospedeiro. SVE eficientemente é ocupados por células na qual eles modulam sua função. Aqui vamos discutir estratégias para abordar o papel do EVs em interações parasita-hospedeiro. Primeiro, nós descrevemos um método simples para a rotulagem e rastreamento EV internalização pelas células endoteliais, usando um corante de vinculador de célula verde. Em segundo lugar, nós relatamos uma maneira simples de medir a permeabilidade através de uma monocamada de células endoteliais usando um fluorescente etiquetado dextrano. Finalmente, mostramos como investigar o papel de pequenas moléculas de RNA não-codificante em função da célula endotelial.
Introduction
De acordo com a Organização Mundial de saúde, havia 212 milhões de novos casos de malária em todo o mundo em 2015 e aproximadamente 429.000 pessoas morreram, principalmente de crianças menores de cinco anos de idade1. Os mecanismos, levando a doença grave, que é frequentemente associada com disfunção vascular, permanecem mal-definidas2. Plasmodium– iRBCs secretam esferas pequenas membrana bi-lipídica conhecidas como vesículas extracelulares (EVs). Sabe-se que esses EVs são potencialmente relevantes para o processo de infecção e a resposta imune do hospedeiro à infecção; no entanto, pouco se sabe sobre a função exata destas pequenas vesículas durante a infecção de malária3. É possível que eles desempenham duas funções importantes: por um lado, eles possam contribuir para a patogênese ativando os macrófagos4,5; e, por outro lado, eles podem mediar a comunicação celular entre parasitas e entre parasitas e anfitrião6,7. Na verdade, parasitas podem transferir proteínas ou ácidos nucleicos entre si através de EVs. Por exemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs pode transferir factor de virulência Serum Resistance-Associated (SRA) e pode ter como alvo outros T. brucei e o host de eritrócitos8. Além disso, por p. falciparum– iRBCs se comunicar entre si através da transferência de ácidos nucleicos dentro EVs. Isso permite que os parasitas otimizar e sincronizar o seu crescimento. Na verdade, EVs podem ser o grande regulador da conversão de Gametócito e, portanto, contribuir para o Regulamento da transmissão etapa7.
Não só fazem EVs regulam os parasitas, eles também mediam interações parasita-hospedeiro. Recentemente, descobri que EVs de iRBCs contenham derivados de anfitrião microRNAs (miRNAs; pequenas espécies de RNA no intervalo de 21-25 nucleotides9) que foram retomadas por células endoteliais humanas. Os miRNAs em EVs formam complexos com Ago2 um estábulo (membro o silenciamento de RNA-induced complex), que uma vez entregue para as células de destinatário, é capaz de especificamente silenciar a expressão de gene e que afetam as propriedades de barreira dos10células. Protocolos padrão foram desenvolvidos para investigar a função do EVs. Aqui, primeiro descrevemos um protocolo que permite que a rotulagem fluorescente do EVs para investigar sua absorção pelas células do destinatários. Além disso, usando um microscópio confocal, é possível rastrear o destino o EV no interior da célula. Vários corantes fluorescentes podem ser usados para rastrear EVs. O corante reativo-amina, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e fluorescentes de calceína-AM se tornar uma vez dentro de vesículas. Nós preferimos usar o rótulo anfifílica, PKH, porque dá um sinal mais brilhante e mais uniforme. Essa abordagem fornece informações importantes para compreender as interações entre células destinatários e EVs. Enquanto em alguns casos EVs se ligam à superfície das células, algumas vesículas rapidamente são retomadas. Após absorção, EVs entregam suas cargas para as células, em que exercem suas funções reguladoras.
Aqui, descrevemos um protocolo para medir a função de barreira de células endoteliais em vitro quantificando a transferência de uma fluorescente dextran através de uma monocamada celular. Marcadores mais sensíveis podem ser usados como marcadores radiolabeled. No entanto, eles exigem precauções especiais de segurança para uso. Outros ensaios existem para medir a função de barreira em vitro como resistência elétrica transendothelial (TEER), que mede a integridade da junção apertada. Finalmente, Visualizar ZO-1, uma proteína da junção apertada, por imunofluorescência permite a avaliação da integridade da junção apertada como bem10. Desde EVs são entidades complexas e heterogêneas, contendo várias cargas com característica potencial de regulamentação, é útil para overexpress um RNA específico para estudar seu efeito sobre a célula de destinatário. Portanto, nós também definir um protocolo que visa gerar linhas de células estáveis expressando a miRNA de juros10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversos parasitas, incluindo Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas desencadear a liberação de EVs pela célula hospedeira infectada. Dependendo dos patógenos, os EVs lançados podem modular a resposta imune do hospedeiro ou mediar a comunicação celular entre os parasitas6. No entanto, há poucas evidências sugerindo como essas pequenas vesículas contribuam para a doença da malária. Aqui, descrevemos várias maneiras de investigar a função do EVs durante a infecção de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financeiramente, este estudo foi suportado em parte pela Fundação Novartis medical – pesquisa biológica (para PYM), o Gottfried e Julia Bangerter-Naraa-Stiftung (para MW e PYM) e a piscina de pesquisa da Universidade de Friburgo (para PYM). Subsídios adicionais incluem as bolsas de excelência de governo suíço para estrangeiros os estudiosos (KAB e SM). Agradecemos a Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess para suporte técnico.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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