Utvärdering av extracellulära vesikler funktion under malariainfektion
Summary
I detta arbete beskriver vi protokoll för att undersöka betydelsen av extracellulära blåsor (EVs) släpptes av Plasmodiumfalciparum infekterade erytrocyter. I synnerhet fokuserar vi på samspelet mellan EVs med endotelceller.
Abstract
Malaria är en livshotande sjukdom som orsakas av Plasmodium parasiter, med P. falciparum är den mest utbredda på den afrikanska kontinenten och ansvarar för de flesta malaria dödsfall globalt. Flera faktorer inklusive parasit kvarstad i vävnader, vaskulär dysfunktion och inflammatoriskt svar påverka utvecklingen av sjukdomen i malaria-infekterade personer. P. falciparum-infekterade röda blodkroppar (iRBCs) släppa små extracellulära blåsor (EVs) som innehåller olika typer av Last molekyler som medla patogenes och cellulär kommunikation mellan värd och parasit. EVs är effektivt tas upp av celler där de modulera deras funktion. Här diskuterar vi strategier för att hantera rollen som EVs i parasit-värd-interaktioner. Först, vi beskriver en enkel metod för märkning och spårning EV internalisering av endotelceller, använda en grön cell linker färgämne. Det andra rapportera vi ett enkelt sätt att mäta permeabilitet över en endotelceller enskiktslager med hjälp av en fluorescently märkt dextran. Slutligen visar vi hur du undersöker rollen av små icke-kodande RNA-molekyler i endotelceller funktion.
Introduction
Enligt Världshälsoorganisationen, fanns det 212 miljoner nya fall av malaria i världen under 2015 och dog ca 429,000 människor, främst barn under fem års ålder1. De mekanismer som leder till svår sjukdom, som ofta är associerad med vaskulär dysfunktion, förblir oklara2. Plasmodium– iRBCs utsöndrar små bi-lipid membranet sfärer kallas extracellulära blåsor (EVs). Det är känt att dessa EVs är potentiellt relevanta infektionsprocessen och värd immunsvaret för infektion. men är lite känt om den exakta funktionen av dessa små blåsor under malaria-infektion3. Det är möjligt att de spelar två viktiga roller: å ena sidan kan de bidra till patogenesen genom att aktivera makrofager4,5. och å andra de kan medla cellulär kommunikation mellan parasiter och mellan parasiter och värd6,7. I själva verket kan parasiter överföra proteiner och nukleinsyror mellan varandra via EVs. Till exempel Trypanosoma brucei rhodesiense EVs kan överföra virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA), och kan rikta både andra T. brucei och värd erytrocyter8. Dessutom kommunicera P. falciparum– iRBCs mellan varandra genom att överföra nukleinsyror inom EVs. Detta tillåter parasiter att optimera och synkronisera sin tillväxt. I själva verket kan EVs vara den stora regulatorn av gametocyte omvandling, och därför bidra till regleringen av den överföring etapp7.
Inte bara reglerar EVs parasiter, de förmedlar också parasit-värd-interaktioner. Vi upptäckte nyligen att EVs från iRBCs innehåller värd-derived mikroRNA (Mirna, små RNA-arter i spänna av 21-25 nukleotider9) som togs upp av mänskliga endothelial celler. MicroRNA i EVs bildar stabila komplex med Ago2 (en medlem av den RNA-inducerad ljuddämpning komplexa), en gång levereras till mottagarens celler, kan som är specifikt tystar genuttryck och påverkar egenskaperna barriär av celler10. Standardprotokoll har utvecklats för att undersöka funktionen av EVs. Här beskriver vi först ett protokoll som tillåter fluorescerande märkning av EVs att undersöka deras upptag av mottagarens celler. Dessutom, genom att använda en confocal Mikroskop, är det möjligt att spåra EVS öde inuti cellen. Flera fluorescerande färger kan användas för att spåra EVs. De amine-reaktivt färgämne, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE) och Calcein-AM blir fluorescerande en gång inuti blåsor. Vi föredrar att använda amfifila etiketten, PKH, eftersom det ger en ljusare och mer enhetlig signal. Detta tillvägagångssätt ger viktig information för att förstå samspelet mellan EVs och mottagarens celler. Medan i vissa fall EVs binder till ytan av cellerna, tas några blåsor snabbt upp. Vid upptag leverera EVs sin last till cellerna, där de utöva sina tillsynsfunktioner.
Här beskriver vi ett protokoll för att mäta barriärfunktionen av endothelial celler in vitro- genom kvantifiering av överföring av en fluorescerande dextran genom en cellulär enskiktslager. Känsligare spårämnen kan användas såsom radiomärkt markörer. De kräver dock särskilda säkerhetsföreskrifter för användning. Andra analyser finns för att mäta barriärfunktionen i vitro såsom transendothelial resistans (TEER), som mäter åtsittande föreningspunkt integritet. Slutligen visualisera ZO-1, ett protein som åtsittande föreningspunkt, genom immunofluorescens tillåter bedömning av åtsittande föreningspunkt integritet som väl10. Eftersom EVs är komplexa och heterogena enheter som innehåller flera laster med potentiella reglerande kännetecken, är det användbart att överuttrycka en specifik RNA för att studera dess effekt på den mottagande cellen. Därför har vi också definiera ett protokoll som syftar till att generera stabila cellinjer som uttrycker miRNA intresse10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera parasiter, inklusive Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania och Trichomonas frisättning av EVs av infekterade värdcellen. Beroende på patogenerna, kan släppt EVT modulera immunsvaret värd eller medla cellulär kommunikation mellan de parasiter6. Ändå finns det lite belägg för hur dessa små blåsor bidra till malaria sjukdom. Här har vi beskrivit flera sätt att undersöka funktionen av EVs under Plasmodium infektion. Exempelvis kan upptaget av EVs av mottagarens celler i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie var ekonomiskt stöds delvis av Novartis Stiftelsen för medicinsk – biologisk forskning (att PYM), Gottfried och Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (till MW och PYM) och forskning poolen av universitetet i Fribourg (till PYM). Ytterligare bidrag inkluderar den schweiziska regeringen Excellence stipendier för utländska akademiker (till KAB och SM). Vi tackar Isabelle Fellay och Solange Kharoubi Hess för teknisk support.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
