Summary

زيجوتيك Fluorescence الانتعاش بعد تبييض الصورة تحليل للارتخاء الكروماتين يتيح التنمية الكاملة ومدتها

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

يظهر الارتخاء الكروماتين أن تشارك في الإمكانات الإنمائية بلاستوميريس. ومع ذلك، لم يتضح ما إذا كان الارتخاء الكروماتين يمكن استخدامها كمؤشر موثوق لإمكانات النمو للأجنة. هنا، قد وصف نظام تجريبي التي يمكن أن تتطور الكروماتين zygotes تقييم الارتخاء لفترة كاملة.

Abstract

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي. مؤخرا، ثبت أن تشارك في إمكانيات التمايز الخلوي للخلايا الجذعية الجنينية pluripotent الكروماتين الارتخاء أو الانفتاح. وذكر سابقا أن مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، ميناء zygotes بنية الكروماتين خففت جداً، مما يوحي بارتباطها بما توتيبوتينسي. ومع ذلك، حتى الآن، قد لم تعالج عما إذا كان هذا الهيكل الكروماتين الغاية خففت/فتح مهم لإمكانات النمو الجنينية. في هذه الدراسة، ولدراسة هذه الفرضية، وضع نظام تجريبي في زيجوتيس التي التي تم تحليلها بواسطة الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة يمكن أن تتطور إلى المدة دون أي أضرار كبيرة. الأهم من ذلك، يحتاج هذا النظام التجريبي فقط سخان الترمس-لوحة بالإضافة إلى المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن الانتعاش الأسفار بعد تبييض الصورة تحليل التحليل (فراب) يمكن استخدامها للتحقيق في ما إذا كانت الأحداث الجزيئية في الكروماتين زيجوتيك هامان للتنمية الكاملة ومدتها.

Introduction

بعد الإخصاب، هو تغيير بنية الكروماتين بشكل حيوي، وهيكل الكروماتين زيجوتيك ثم أنشئت في نهاية المطاف1،2. خلال هذه الفترة، والأب برونوكلي، يتم تغيير البروتين الكروماتين المهيمنة من البروتامين إلى هيستون. الكروماتين الناتجة من مختلف للغاية من الحيوانات المنوية وبويضات الإناث في عدة نقاط (مثلاً، التكوين البديل هستون، هستون تعديل). وهكذا، يعتقد الكروماتين زيجوتيك شكلت مهمة للتنمية الجنينية اللاحقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من الجهود المبذولة للكشف عن تفاصيل هيكل الكروماتين زيجوتيك على مدى فترات طويلة، أساليب لتقييم نوعية زيجوتيس أو للتنبؤ بتنميتها الأجل الكامل في مرحلة واحدة-خلية عن طريق تحليل بنيتها الكروماتين لم تكن المنشأة.

في الدراسة السابقة، فهو اكتشف أن zygotes هيكل الكروماتين خففت الغاية3. في الوقت الراهن، يعتقد أن يكون عاملاً هاما في التمايز الخلوي المحتملة في الخلايا الجذعية الجنينية (ES)4الارتخاء الكروماتين أو الانفتاح. دإط الخلايا لا يحمل التجانس في الطبيعة، ولكن بدلاً من ذلك غير المتجانسة؛ في مستعمرات الخلايا دإط، اكتساب بعض عابر إمكانية تفريق أعلى يماثل blastomeres المرحلة اثنين خلايا الأجنة. خلال هذه المرحلة الانتقالية إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة، خلايا الكروماتين الارتخاء في وفاق التغييرات إلى ما قابل للمقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة5. وهكذا، يبدو الارتخاء الكروماتين لتكون هامة لإمكانيات التمايز الخلوي وأنه من الممكن أن فتح الكروماتين على نطاق واسع في زيجوتيس مفيد لتقييم الإمكانات الإنمائية زيجوتيك.

تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي حيث يسمح هذا الأسلوب لذلك من تنمية وتطوير كامل المدة حتى6. وقد استخدمت تحليل فراب كأحد أساليب التصوير الحي، دراسة الارتخاء الكروماتين في الأجنة preimplantation وداط الخلايا3،،من45. إذا كان يمكن تحليل الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون أثر ضار على التنمية الكاملة ومدتها بتحليل فراب، قد يكون أداة قيمة لتقييم نوعية الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية. ومع ذلك، قد لا درست آثار على التنمية على المدى الكامل بهذا الأسلوب التجريبي. مؤخرا، تم تطوير نظام تجريبي لاستخدام فراب لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك. لأن هذا نظام جديد لمراقبة زيجوتيس، وقد وصفته فراب زيجوتيك (زفراب). زفراب لم تؤثر على التنمية على المدى الكامل خطيرة، وقد ذكرت في مكان آخر7. ويرد في هذا التقرير، البروتوكول هذا الأسلوب التجريبي.

Protocol

وأجرى هذه الدراسة يتفق بشكل صارم مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجامعة ياماناشي. البروتوكول أقرته لجنة “أخلاقيات التجارب الحيوانية” من جامعة ياماناشي (تصريح رقم: A24-50). وأجريت جميع العمليات الجراحية تحت التخدير تريبروموثانول، وقد بذلت جميع الجهود للتقل?…

Representative Results

تحليل زفراب مع اجفب-H2B تنتج بشكل صحيح تم حقن مرناً ترميز H2B اجفب، الذي ينظر إليه بسبب عصابة تحول بولي تراجع (الشكل 2A)، في السيتوبلازم زيجوتيس مع جسم القطبي 2 في 1-3 ح بعد التلقيح (الشكل 2). 8 إلى 12 ح بعد التلقيح، زيج…

Discussion

تحليل زفراب كما اتضح في هذه الدراسة، لا يسبب الضرر الحرجة للتنمية على المدى الكامل، مما يوحي بهذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية للكشف عن الرابطة بين الأحداث الجزيئية وإمكانية إنمائية الجنينية. أثناء إعادة برمجة، إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة دإط الخلايا، ومن خلالها إمكانيات تفضيلية لتلك ال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر ساتوشي كيشيجامي، واكاياما ساياكا، هيرواكي ناغاتومو، كاميمورا ساتوشي، وكانا كيشيدا لتوفير الدعم التقني والتعليقات الانتقادية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بالبرنامج وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا لتعزيز الإصلاح للجامعات الوطنية إلى مو؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (16 ح 02593) ومؤسسة العلوم اسادا ومؤسسة العلوم وتاكيدا ل T.W. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Play Video

Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

View Video