Zygotic Fluoreszenz Erholung nach dem Foto-bleichen-Analyse für Chromatin Lockerheit, die volle Laufzeit Entwicklung ermöglicht
Summary
Chromatin Lockerheit scheint das Entwicklungspotenzial der Blastomeren beteiligt zu sein. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Chromatin Lockerheit als ein zuverlässiger Index für das Entwicklungspotenzial für Embryonen verwendet werden kann. Hier wurde ein experimentelles System in dem Chromatin Lockerheit bewertet Zygoten, volle Amtszeit entwickeln können beschrieben.
Abstract
Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese. Vor kurzem hat Chromatin Lockerheit oder Offenheit gezeigt an das zelluläre Differenzierung Potenzial der pluripotenten embryonalen Stammzellen zu beteiligen. Es wurde bereits berichtet, dass im Vergleich mit embryonalen Stammzellen Zygoten beherbergen eine extrem gelockert Chromatinstruktur, was auf seine Verbindung mit ihren Totipotenz. Allerdings ist bis jetzt nicht angesprochen worden ob diese extrem gelockert/offene Chromatinstruktur für embryonale Entwicklungspotenzial wichtig ist. In der vorliegenden Studie wurde entwickelt, um diese Hypothese zu prüfen ein experimentelles System in die, das Zygoten, die durch Fluoreszenz analysiert wurden Erholung nach dem Foto bleichen Begriff ohne erhebliche Schäden entwickeln kann. Wichtig ist, braucht dieses experimentelle System nur eine Thermoskanne-Platte Heizung neben einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse dieser Studie deuten, Fluoreszenz-Erholung nach Foto-bleichen-Analyse (FRAP)-Analyse verwendet werden kann, zu untersuchen, ob die molekularen Ereignisse im zygotic Chromatin für voll ausgetragenen Entwicklung wichtig sind.
Introduction
Nach der Befruchtung die Chromatinstruktur ist dynamisch verändert und zygotic Chromatinstruktur ist dann schließlich etablierte1,2. Während dieser Zeit, im väterlichen Vorkerne wird die dominante Chromatin-Proteins von Protamin in Histon geändert. Die daraus resultierende Chromatin ist sehr verschieden von der Spermien und weibliche Eizellen in mehreren Punkten (z.B., Histon Variante Komposition, Histon-Modifikation). So wird gebildeten zygotic Chromatin gedacht, um für spätere embryonale Entwicklung wichtig sein. Jedoch trotz der Bemühungen um die Einzelheiten der zygotic Chromatinstruktur über einen längeren Zeitraum zu offenbaren, noch Methoden zur Bewertung der Qualität von Zygoten oder ihre volle Laufzeit Entwicklung im 1-Zell-Stadium vorherzusagen, durch die Analyse ihrer Chromatinstruktur war nie gegründet.
In der vorangegangenen Studie ist es entdeckt, dass Zygoten eine extrem gelockert Chromatin Struktur3. Derzeit ist Chromatin Lockerheit oder Offenheit vermutlich ein wichtiger Faktor für die zelluläre Differenzierung Potenzial embryonaler Stammzellen (ES) Zellen4. ES-Zellen weisen nicht auf Homogenität in der Natur, sondern sind eher heterogen; in ES Zelle Kolonien erwerben einige vorübergehend ein höhere Differenzierung Potenzial Blastomeren zwei-Zell-Stadium Embryos vergleichbar. Während dieses Übergangs in die zwei-Zelle wie Staat Zellen Chromatin Lockerheit in ES verwandelt sich in was mit zwei-Zell-Stadium Embryonen5vergleichbar ist. So scheint Chromatin Lockerheit wichtig sein für zelluläre Differenzierung Potenzial und es ist möglich, die ausgiebig Chromatin in Zygoten öffnen ist nützlich für die Bewertung der zygotic Entwicklungspotenzial.
Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese, da diese Methode ermöglicht eine spätere Entwicklung und sogar voll ausgetragenen Entwicklung6. Als einer der live bildgebenden Verfahren wurde FRAP Analyse zur Chromatin Lockerheit in preimplantation Embryos und ES Zellen3,4,5zu prüfen. Wenn zygotic Chromatin Lockerheit durch FRAP Analyse ohne eine nachteilige Wirkung auf voll ausgetragenen Entwicklung analysiert werden kann, kann es sein, ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Qualität der Embryonen im 1-Zell-Stadium. Allerdings sind die Auswirkungen auf die volle Laufzeit Entwicklung von dieser experimentellen Methode nicht untersucht worden. Vor kurzem wurde ein experimentelles System mit FRAP auszuwertende zygotic Chromatin Lockerheit entwickelt. Da dies ein neues Beobachtungssystem für Zygoten war, wurde es als zygotic FRAP (zFRAP) bezeichnet. zFRAP nicht voll ausgetragenen Entwicklung kritisch auf und wurde an anderer Stelle7gemeldet. In diesem Bericht wird das Protokoll dieser experimentellen Methode beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in dieser Studie offenbart, verursacht die zFRAP Analyse keine kritischen Schaden voll ausgetragenen Entwicklung, was darauf hindeutet, dass diese Methode ist ein sehr nützliches Tool um die Zuordnung zwischen molekularen Ereignisse und das embryonale Entwicklungspotenzial zu offenbaren. Während der Reprogrammierung, in der zwei Zellen wie Staat der ES-Zellen, die wodurch die differenzielle Potenzial dieser Zellen so hoch wie die der zwei-Zell-Stadium Embryos wird wandelt Chromatin Lockerheit, die vergleichbar mit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura und Kana Kishida für die kritischen Anmerkungen und technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Programm zur Förderung der Reform der Universitäten des Landes, M.O.; der Japan Society for the Promotion of Science (16H 02593), Asada Science Foundation und der Takeda Science Foundation, t.w. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
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