Zygotisk fluorescens opsving efter foto-blegning analyse for kromatin løshed, der giver mulighed for fuld-sigt udvikling
Summary
Kromatin løshed synes at være involveret i den udviklingsmæssige potentiale af blastomeres. Det vides dog ikke, om kromatin løshed kan bruges som en pålidelig indeks for den udviklingsmæssige potentiale for embryoner. Her, er blevet beskrevet en eksperimentel system hvor kromatin løshed-evalueret zygotes kan udvikle sig til fuld sigt.
Abstract
Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for analyse af molekylære begivenheder under ontogenesis. For nylig, kromatin løshed eller åbenhed har vist sig at være involveret i cellulære differentiering potentiale af pluripotente stamceller fra embryoner. Det blev tidligere rapporteret, sammenlignet med embryonale stamceller, zygotes havnen en ekstremt løsnede kromatin struktur, tyder på sin forening med deres totipotency. Men indtil nu, det er ikke blevet behandlet om denne yderst løsnes/open kromatin struktur er vigtigt for embryonale udviklingsmæssige potentiale. I den foreliggende undersøgelse, for at undersøge denne hypotese, blev en eksperimentel system i hvilke zygotes, der blev analyseret af fluorescens opsving efter foto-blegning kan udvikle sigt uden nogen betydelige skader udviklet. Vigtigst, systembehov denne eksperimentelle kun Termokande-plade varmelegeme ud over en Konfokal laser scanning mikroskop. Resultaterne af denne undersøgelse tyder at fluorescens opsving efter foto-blegning analyse (FRAP) analyse kan bruges til at undersøge, om de molekylære begivenheder i zygotisk kromatin vigtigt for fuldbårne udvikling.
Introduction
Efter befrugtningen, kromatin struktur ændres dynamisk og zygotisk kromatin struktur er derefter i sidste ende etableret1,2. I denne periode, faderlige pronuclei, er dominerende kromatin protein ændret fra protamine til Histon. Den resulterende kromatin er meget forskellig fra sperms og kvindelige oocyter i flere punkter (fx, Histon variant sammensætning, Histon ændring). Således menes dannet zygotisk kromatin at være vigtig for efterfølgende embryonale udvikling. Trods bestræbelser på at afsløre detaljer om zygotisk kromatin struktur over lange perioder, har metoder til at vurdere kvaliteten af zygotes eller at forudsige deres fuldbårne udvikling på én-celle stadium ved at analysere deres kromatin struktur dog aldrig været etableret.
I den tidligere undersøgelse, er det opdaget, at zygotes har en ekstremt løsnede kromatin struktur3. I øjeblikket, menes kromatin løshed eller åbenhed at være en vigtig faktor for Celledifferentiering potentielle i embryonale stamceller (ES) celler4. ES-celler udstille ikke homogenitet i naturen, men er temmelig heterogene; i ES celle kolonier erhverve nogle forbigående en højere differentiering potentiale svarende til blastomeres to-celle stadium embryoner. Under denne overgang ind i to-cellen som stat celler kromatin løshed i ES ændringer i hvad er sammenlignelige med to-celle stadium embryoner5. Kromatin løshed synes således at være vigtig for cellulære differentiering potentiale og det er muligt, at omfattende åbne kromatin i zygotes er nyttige til vurdering af zygotisk udviklingsmæssige potentiale.
Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for analyse af molekylære begivenheder under ontogenesis, da denne metode giver mulighed for efterfølgende udvikling og endda fuldbårne udvikling6. Som en af de live imaging metoder, er FRAP analyse blevet brugt til at undersøge kromatin løshed i præimplantations embryoner og ES celler3,4,5. Hvis zygotisk kromatin løshed kan analyseres uden en skadelig virkning på fuldbårne udvikling af FRAP analyse, kan det være et værdifuldt redskab til evaluering af kvaliteten af embryoner på én-celle stadium. Effekter på fuld-sigt udvikling af denne eksperimentelle metode er dog ikke undersøgt. For nylig, en eksperimenterende system ved hjælp af FRAP for at evaluere zygotisk kromatin løshed blev udviklet. Fordi dette var en ny observationssystem til zygotes, var det kaldes zygotisk FRAP (zFRAP). zFRAP påvirkede ikke kritisk fuldbårne udvikling og har været rapporteret et andet sted7. I denne betænkning, er protokollen af denne eksperimentelle metode beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som åbenbaret i denne undersøgelse, forårsage zFRAP analyse ikke kritisk skade fuldbårne udvikling, tyder på, denne metode er et meget nyttigt redskab til at afsløre sammenhængen mellem molekylære begivenheder og embryonale udviklingsmæssige potentiale. Under omprogrammering, ind i to-cellen som stat af ES-celler, hvorved differential potentialet i disse celler bliver så stor som to-celle stadium embryoner, ændringer kromatin løshed ind, at sammenlignelige med to-celle stadium embryoner5</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura og Kana Kishida for kritiske kommentarer og teknisk support. Dette arbejde blev delvist finansieret af Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi-program for at fremme reformen af nationale universiteter til M.O.; Japan-samfund til fremme af videnskab (16H 02593), Asada Science Foundation og Takeda Science Foundation til T.W. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
