Zygotic fluorescens utvinning etter Foto-bleking analyse for Chromatin Looseness som tillater Full sikt utvikling
Summary
Chromatin løshet synes å være involvert i den utviklingsmessige potensialet av blastomeres. Men er det ikke kjent om chromatin løshet kan brukes som en pålitelig indeks for den utviklingsmessige potensialet for embryoer. Her, har en eksperimentell system der chromatin løshet-vurdert zygotes kan utvikle til full sikt blitt beskrevet.
Abstract
Live bildebehandling er et kraftig verktøy som tillater analyse av molekylære hendelser under ontogenesis. Nylig har chromatin løshet eller åpenhet vist å være involvert i differensiering potensialet i pluripotent stamceller. Den tidligere rapportert som sammenlignet med embryonale stamceller, zygotes havn en ekstremt løsnet chromatin struktur, antyder sin tilknytning til deres totipotency. Men inntil nå, har det ikke vært adressert om denne ekstremt løsnet/åpne chromatin strukturen er viktig for embryonale utviklingsmessige potensiale. Studien, for å undersøke denne hypotesen, ble en eksperimentell systemet som zygotes som ble analysert av fluorescens utvinning etter Foto-bleking kan utvikle begrepet uten betydelig skade utviklet. Viktigere, trenger eksperimentelle systemet bare en termos-plate ovn i tillegg til en AC confocal laserskanning mikroskop. Resultatene av denne studien tyder på at fluorescens utvinning etter Foto-bleking analyse (FRAP) analyse kan brukes til å undersøke om molekylære hendelsene i zygotic chromatin er viktig for hele.
Introduction
Chromatin strukturen endres dynamisk etter befruktning, og zygotic chromatin strukturen er så til slutt etablerte1,2. I denne perioden i fars pronuclei, endres dominerende chromatin protein fra protamine i histone. Den resulterende chromatin er svært forskjellig fra sperms og kvinnelige oocytes i flere poeng (f.eks, histone variant komposisjon, histone endring). Dermed er dannet zygotic chromatin antatt å være viktig for embryonale utvikling. Men tross forsøk på å avsløre detaljer om zygotic chromatin struktur over lengre perioder, har metoder å vurdere kvaliteten på zygotes eller å forutsi deres full sikt utvikling på en celle scenen ved å analysere chromatin strukturen aldri vært etablert.
I den tidligere studien, er det oppdaget at zygotes har en ekstremt løsnet chromatin struktur3. Foreløpig antas chromatin løshet eller åpenhet å være en viktig faktor for differensiering i embryonic stem (ES) celler4. ES celler stiller ikke homogenitet i naturen, men er heller heterogen; i ES celle kolonier kjøpe noen transiently et høyere differensiering potensial sammenlignes med blastomeres av to-celle scenen embryo. I løpet av denne overgangen til to-cellen tilstand celler chromatin løshet inne ES endringer i hva er sammenlignbare med to-celle scenen embryo5. Dermed synes chromatin løshet å være viktig for differensiering potensial og det er mulig at mye åpne chromatin i zygotes er nyttig for vurdering av zygotic utviklingsmessige potensiale.
Live bildebehandling er et kraftig verktøy som tillater analyse av molekylære hendelser under ontogenesis siden gir denne metoden utvikling og enda full sikt utvikling6. Som en av metodene for live bildebehandling, har FRAP analyse blitt brukt til å undersøke chromatin løshet inne preimplantation embryoer og ES celler3,4,5. Hvis zygotic chromatin løshet kan analyseres uten virkning på hele utviklingen av FRAP analyse, kan det være et verdifullt verktøy for vurdering av kvaliteten på embryoer på en celle scenen. Men har effekten på hele utviklingen av denne eksperimentelle metoden ikke blitt undersøkt. Nylig ble en eksperimentell systemet bruker FRAP evaluere zygotic chromatin løshet utviklet. Fordi dette var et nytt observasjon system for zygotes, var det betegnet som zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP ikke kritisk påvirke hele utvikling og har blitt rapportert andre steder7. Protokoll for denne eksperimentell metode er beskrevet i denne rapporten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som i denne studien, medfører zFRAP analysen ikke kritiske skader hele utvikling, tyder denne metoden er et veldig nyttig verktøy å avsløre tilknytningen mellom molekylære hendelser og den embryonale utviklingsmessige potensialet. Under reprogramming, i to-cellen som delstaten ES celler som differensial potensialet i disse cellene blir så høy som i to celler scenen embryoer, endres chromatin løshet i det sammenlignbare med to-celle scenen embryo5. Følgelig er det mulig at zygotic chromati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura og Kana Kishida for å gi kritiske kommentarer og kundestøtte. Dette arbeidet ble delvis finansiert av programmet Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi for å fremme reform av nasjonale universiteter å M.O.; Japan Society for fremme av vitenskap (16H 02593), Asada Science Foundation og Takeda Science grunnlaget for T.W. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
