Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse
Summary
Denne metoden viser hvordan du visualisere patogen invasjonen i insekt celler med tredimensjonale (3D) modeller. Hemocytes fra Drosophila Larvene var infisert med virus eller bakterielle patogener, ex vivo eller i vivo. Infiserte hemocytes ble deretter fast og farget for bildebehandling med AC confocal mikroskop og påfølgende 3D cellular rekonstruksjon.
Abstract
Under patogene infeksjon av Drosophila melanogaster, spiller hemocytes en viktig rolle i immunforsvaret gjennom infeksjonen. Dermed er målet med denne protokollen å utvikle en metode for å visualisere den patogen invasjonen i en spesifikk immun kupé av fluer, nemlig hemocytes. Ved hjelp av metoden som presenteres her, opptil 3 × 10 kan6 live hemocytes fås fra 200 Drosophila 3rd skikkelsen larver i 30 min ex vivo infisert. Alternativt kan hemocytes være infisert i vivo gjennom injeksjon av 3rd skikkelsen Larvene etterfulgt av hemocyte utvinning til 24 timer etter infeksjon. Disse infiserte primære celler ble løst, beiset og fotografert bruker AC confocal mikroskopi. Deretter ble 3D representasjoner generert fra bilder å vise definitivt patogen invasjon. I tillegg høykvalitets RNA for qRT PCR kan oppnås for påvisning av patogen mRNA følgende infeksjon og tilstrekkelig protein kan trekkes fra disse cellene for Western blot analyse. Sammen presenterer vi en metode for bestemt avstemming av patogen invasjonen og bekreftelse av infeksjon med bakteriell og viral patogen typer og effektiv metode for hemocyte utvinning få nok live hemocytes fra Drosophila Larvene for ex vivo og i vivo infeksjon eksperimenter.
Introduction
Drosophila melanogaster er en veletablert modell organisme for studier av medfødt immunitet1. Under medfødte immunforsvaret spiller hemocytes en viktig rolle i svaret til patogen utfordring. Hemocytes er avgjørende for innkapsle parasitter, samt har en viktig funksjon i å bekjempe patogen gjennom phagocytic aksjon under sopp, viral og bakteriell infeksjon2,3.
For å best forstå vertens medfødte immunforsvaret til sykdomsfremkallende mikrober infeksjon, er det viktig å visualisere hvordan patogen invaderer vertsceller under infeksjon. Denne effekten bidrar til en forståelse av mekanismen for invasjon. Detaljer av patogen intracellulær lokalisering og cellulær respons, kan disse dataene gi hint om vert respons på infeksjon og mobilnettet organeller som mikrobe samhandler. Dermed kan 3D modell gjenoppbygging etter avbildning av mikroskopi være nyttig å finne nøyaktige plasseringen av patogener i verten cellene. I denne studien visualisert vi invasjonen av Coxiella burnetii (C. burnetii), den utløsende agenten for Q feber, en zoonotiske sykdommer som utgjør en alvorlig trussel for både mennesker og dyr helse, i primære Drosophila hemocytes. Nylig ble det vist at Drosophila er utsatt til biosikkerhet nivå 2 ni mil fase II (NMII) klone 4 stammen av C. burnetii og at denne belastningen er stand til å gjenskape i Drosophila4, som angir at Drosophila kan brukes som en modell organisme for å studere C. burnetii patogenesen.
Tidligere studier har brukt hemocytes for å undersøke vertens medfødte immunforsvaret. Hemocytes har vært brukt i morfologiske observasjoner5,6,7, morphometric analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent analyse10,12, immunostai-13, immunoblotting3,10, 11 og immunohistochemistry9,14. Selv om Drosophila S2 celler er også tilgjengelig for forskjellige i vitro eksperimenter, endre immortalization og potensielle eksisterende virusinfeksjon sin atferd15,16. Bruk av primære celler i motsetning til en udødeliggjort cellen linje, for eksempel S2 celler, tillater for studier av medfødte immunforsvar i et system mer representative for hele organismen. I tillegg gir infeksjon av hemocytes i vivo, før ekstraksjon, cellene å samhandle med andre vert proteiner og vev, en fordel over utvinning av hemocytes før ex vivo infeksjon. En rekke ulike metoder har blitt benyttet for å få et tilstrekkelig antall hemocytes i løpet kort tid å holde hemocytes i live8,17,18,19.
I denne studien presenterer vi en metode for å trekke ut hemocytes fra Drosophila 3rd skikkelsen Larvene sykdomsfremkallende mikrober infisert med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller virvelløse dyr iriserende virus 6 (IIV6). Vi beskriver metodene for både i vivo og ex vivo hemocyte infeksjoner. I vivo– og ex vivo-infiserte hemocytes var visualisert med AC confocal mikroskopi og brukes til å lage 3D-modeller av C. burnetii invasjon. I tillegg ved hjelp av utvinning, ex vivo-infiserte hemocytes ble brukt til genet og protein uttrykk analyser. Spesielt for å undersøke omfanget av infeksjon med IIV6 og Listeria, ble totalt RNA eller protein isolert fra celler for qRT PCR eller Western blot analyse. Samlet protokollen inneholder metoder for å raskt samle høyt antall hemocytes fra 3rd skikkelsen larver og bevis at primære hemocytes, infisert i vivo eller ex vivo, er en passende plattform for mikrobiell patogen infeksjon studier og gjeldende nedstrøms analyser som mikroskopi, transcriptomics og Proteomikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
For bedre å forstå hvordan verten cellene blir smittet, er det viktig å avklare lokaliseringen av patogen i cellene, spesielt når eksperimentere på tidligere testet patogen og celle type kombinasjoner4. Mens studere cellulær respons kaskade etter infeksjon kan angi produktiv patogen invasjon, er kombinasjonen av tenkelig og cellulær respons viktig å demonstrere patogen invasjon og infeksjon. Mens rapporter som viser 2D-bilder av patogen invasjonen i verten cellene pleier å indikere produk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Dr. Robert Heinzen for å gi bestander av mCherry-uttrykke Coxiella burnetii. Vi takker Dr. Luis Teixeira for å gi virvelløse iriserende virus 6 og Bloomington lager Center for å gi fly aksjer. Prosjektet ble finansiert delvis NIH grant R00 AI106963 (til A.G.G.) og Washington State University.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
