Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva
Summary
Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.
Abstract
Drosophila melanogaster, patojenik enfeksiyon sırasında hemocytes enfeksiyon boyunca bağışıklık yanıtındaki önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, bu iletişim kuralının amacı belirli bir bağışıklık yerde uçar, yani hemocytes patojen işgali görselleştirmek için bir yöntem geliştirmektir. Burada 3 × 10 anlatılan yöntemle6 canlı hemocytes 200 Drosophila 3rd INSTAR larva ex vivo enfeksiyon için 30 dk içinde elde edilebilir. Alternatif olarak, hemocytes enfekte vivo içinde 3rd INSTAR larva için 24 saat sonrası enfeksiyon hemocyte çıkarma tarafından takip enjeksiyon yoluyla olabilir. Bu virüslü primer hücre tespit edildi, lekeli ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma. Sonra 3D temsilcilikleri patojen işgal kesin olarak göstermek için görüntülerden üretildi. Ayrıca, yüksek kaliteli RNA qRT-PCR patojen mRNA şu tespiti için elde edilebilir enfeksiyon ve yeterli protein hulâsa Western blot analizi için bu hücrelerden. Birlikte ele alındığında, biz patojen işgalinin kesin uzlaşma ve enfeksiyon bakteriyel ve viral patojen türleri ve verimli bir yöntem hemocyte çıkarılması için yeterli canlı hemocytes Drosophila elde etmek için kullanarak onay için bir yöntem mevcut larva ex vivo ve in vivo enfeksiyon deneyler için.
Introduction
Drosophila melanogaster doğuştan gelen bağışıklık1incelenmesi için bir iyi kurulmuş model organizmadır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı sırasında hemocytes yanıt patojeni meydan okuma olarak önemli bir rol oynamaktadır. Hemocytes mantar, viral ve bakteriyel enfeksiyon2,3sırasında fagositik eylem yoluyla patojen mücadelede önemli bir işleve sahip yanı sıra parazit Kapsüllenen için kritik öneme sahiptir.
En iyi ana bilgisayarın doğuştan gelen bağışıklık yanıtı patojenik mikrobiyal enfeksiyon anlamak için nasıl patojen konak hücreleri enfeksiyon sırasında işgal görselleştirmek önemlidir. Bu görselleştirme işgali mekanizmasının bir anlaşmaya katkıda bulunur. Patojen hücre içi yerelleştirme ayrıntılarını ve hücresel yanıt ile birlikte, bu veriler enfeksiyon ve hangi ile mikrop etkileşim hücre organelleri ana bilgisayar yanıt hakkında ipuçları sağlar. Böylece, 3D modeli yeniden görüntüleme mikroskobu tarafından sonra konak hücreleri patojenler tam yerini belirlemek yararlı olabilir. Bu çalışmada, Avusturya’nın Coxiella burnetii (C. burnetii), Q ateşi, insan ve hayvan sağlığı için ciddi bir tehdit teşkil etmektedir birincil Drosophila hemocytes Hayvansal bir hastalık hastalığının görüntülenir. Son zamanlarda, Drosophila 2 dokuz mil faz II (NMII) klon C. burnetii 4 suşu ve bu zorlanma Drosophila4‘ te, çoğaltmak yapabiliyor bu gösteren Biyogüvenlik düzeyi duyarlı gösterilmiştir Drosophila C. burnetii patogenezi okumaya bir model organizma kullanılır.
Önceki çalışmalarda hemocytes ana bilgisayarın doğuştan gelen bağışıklık yanıtı incelemek için kullandık. Hemocytes kullanılan morfolojik gözlemleri5,6,7, xarakteristikaları analiz2,8, fagositoz analiz2,3, qRT-PCR2 için , 9, immunoprecipitation10,11, immünfloresan analiz10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 ve immünhistokimya9,14. Drosophila S2 hücreleri de çeşitli vitro deneyler için kullanılabilir olmakla birlikte, onların davranış15,16-əbadoləşdirmək ve önceden var olan potansiyel viral enfeksiyon değiştirmek. Primer Hücre S2 hücreleri gibi bir ölümsüzleştirdi hücre kültürünü aksine kullanımı doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu çalışma için bir sistem tüm organizmanın daha temsilcisi sağlar. Ayrıca, hemocytes vivo, ayıklama önce enfeksiyonu hücrelere diğer ana bilgisayar proteinler ve doku, hemocytes ex vivo enfeksiyonu önce çıkarılması üzerinde bir avantaj etkileşim sağlar. Birkaç farklı yöntem hemocytes yeterli sayıda hemocytes canlı8,17,18,19tutmak için zaman kısa bir süre içinde elde etmek için kullanılmıştır.
Bu çalışmada, biz Drosophila 3rd INSTAR larva C. burnetii, Listeria Monositogenez (Listeria) veya omurgasız yanardöner patojenik mikrobiyal enfeksiyon için hemocytes ayıklamak için bir yöntem mevcut virüs 6 (IIV6). Vivo ve ex vivo hemocyte enfeksiyon yöntemleri açıklanmaktadır. Vivo– ve ex vivo-virüslü hemocytes confocal mikroskobu ile görüntülenir ve C. burnetii işgalinin 3D modeller oluşturmak için kullanılır. Buna ek olarak, ex vivoayıklama iletişim kuralını kullanarak-virüslü hemocytes için gen ve protein ifadesi kullanılmıştır deneyleri. Özellikle, IIV6 ve Listeriaenfeksiyonu ölçüde incelemek için toplam RNA veya protein qRT-PCR veya Western blot analizi için hücrelerden izole edildi. Birlikte ele alındığında, protokol hızla hemocytes sayısının fazlalığı 3rd INSTAR larva ve birincil hemocytes, in vivo veya ex vivoenfekte kanıt toplamak için yöntemler sağlar, için uygun bir platform olan mikrobiyal patojen enfeksiyon çalışmaları ve ilgili aşağı akım analizleri mikroskobu, transcriptomics ve proteomik gibi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nasıl konak hücreleri enfekte olma daha iyi anlamak için özellikle daha önce denenmemiş patojen ve hücre tipi kombinasyonları4‘ te deneme zaman patojen hücrelerdeki lokalizasyonu netleştirmek önemlidir. Enfeksiyonu takip hücresel yanıt basamaklı eğitim üretken patojen işgali gösterebilir iken, görüntüleme ve hücresel yanıt verilerini kombinasyonu patojen işgali ve enfeksiyon göstermek için önemlidir. Patojen işgalinin 2D görüntüleri ana hücreleri gösteren raporlar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCherry ifade Coxiella burnetiistokları sağlamak için Dr Robert Heinzen için minnettarız. Biz Dr Luis Teixeira omurgasız yanardöner virüs 6 ve Bloomington stok merkezi sinek stokları sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu projenin kısmen NIH hibe R00 AI106963 (A.G.G.) ve Washington State Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
