Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis
Summary
Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.
Abstract
Durante la infección patógena de Drosophila melanogaster, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta inmune durante la infección. Así, el objetivo de este protocolo es desarrollar un método para visualizar la invasión del patógeno en un compartimiento inmune específico de las moscas, es decir, hemocitos. El método presentado aquí, 3 × 106 vivo hemocitos pueden obtenerse 200 larvas de Drosophila 3rd estadio en 30 min para la infección ex vivo . Alternativomente, hemocitos pueden ser infectado en vivo a través de la inyección de 3 larvas de estadiord seguido por extracción hemocyte a la infección después de 24 h. Estas células infectadas de la primaria fueron fijadas, teñidos y reflejada usando microscopia confocal. Entonces, se generaron representaciones 3D de las imágenes para mostrar definitivamente la invasión de patógenos. Además, se puede obtener RNA de alta calidad para qRT-PCR para la detección de siguiente de mRNA de patógeno infección y suficiente proteína pueden ser extraído de estas células para el análisis de Western blot. Tomados en conjunto, se presenta un método para la reconciliación definitiva de la invasión de patógenos y confirmación de la infección con tipos de patógeno bacterianos y virales y un método eficiente para la extracción de hemocyte obtener suficiente energizados hemocitos de Drosophila larvas para experimentos de infección ex vivo e in vivo .
Introduction
Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido para el estudio de la inmunidad innata1. Durante la respuesta inmune innata, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta al desafío de patógeno. Hemocitos son cruciales para el encapsulamiento de parásitos, así como tener una función importante en la lucha contra el patógeno a través de la acción fagocítica durante la infección por hongos, virales y bacterianas2,3.
Para mejor entender la respuesta inmune innata del hospedador a la infección microbiana patógena, es importante visualizar cómo el patógeno invade las células del huésped durante la infección. Esta visualización contribuye a una comprensión del mecanismo de invasión. Junto con los datos de localización intracelular del patógeno y la respuesta celular, estos datos pueden proporcionar pistas sobre la respuesta del huésped a la infección y los orgánulos celulares con los cuales interactúa el microbio. Por lo tanto, reconstrucción 3D modelo después de la proyección de imagen por microscopia puede ser útil para determinar la ubicación precisa de los patógenos en las células del huésped. En este estudio, visualizamos la invasión de Coxiella burnetii (C. burnetii), el agente causal de la fiebre Q, una enfermedad zoonótica que plantea una grave amenaza para la salud humana y animal, en primarias hemocitos de Drosophila . Recientemente, se demostró que la Drosophila son susceptibles al nivel de bioseguridad 2 fase nueve milla II (NMII) clon 4 cepa de C. burnetii y que esta cepa es capaz de replicarse en Drosophila4, indicando Drosophila puede utilizarse como un organismo modelo para estudiar la patogenesia de C. burnetii .
Estudios previos han utilizado hemocitos para examinar la respuesta inmunológica innata del hospedador. Hemocitos se han utilizado para observaciones morfológicas5,6,7, morfométricos análisis2,8, fagocitosis análisis2,3, qRT-PCR2 , 9, inmunoprecipitación10,11, análisis inmunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Aunque las células S2 de Drosophila también están disponibles para varios experimentos en vitro , inmortalización y potencial infección viral existente cambian su comportamiento15,16. El uso de pilas en lugar de una línea celular inmortalizada, como células de S2, permite el estudio de la función inmune innata en un sistema más representativo de todo el organismo. Además, la infección de hemocitos en vivo, antes de la extracción, permite a las células interactuar con otras proteínas de host y el tejido, una ventaja sobre extracción de hemocitos antes infección ex vivo . Un número de diferentes métodos se han utilizado para obtener un número suficiente de hemocitos en un corto período de tiempo para mantener los hemocitos vivo8,17,18,19.
En este estudio, se presenta un método para extraer hemocitos de larvas de Drosophila 3rd estadio de infección microbiana patógena con C. burnetii, Listeria monocytogenes (listeriosis) o invertebrados iridiscente Virus 6 (IIV6). Se describen los métodos para las infecciones hemocyte tanto in vivo y ex vivo . In vivoy ex vivo-hemocitos infectados fueron visualizadas con microscopía confocal y usados para construir modelos 3D de invasión de C. burnetii . Además, usando el protocolo de extracción, ex vivo-hemocitos infectados fueron utilizados para la expresión de gene y proteína ensayos. Específicamente, para examinar el grado de infección por IIV6 y Listeria, proteína o RNA total fue aislada de las células para qRT-PCR o análisis de Western blot. Tomados en conjunto, el protocolo proporciona métodos para recolectar rápidamente un número elevado de hemocitos de 3 larvas de estadio de lard y evidencia que los hemocitos primarias, infectado ya sea en vivo o ex vivo, son una plataforma conveniente para microbiana estudios de infección de los patógenos y análisis posteriores aplicables como la microscopía, transcriptómica y proteómica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para entender mejor cómo se infectan las células del huésped, es importante aclarar la localización del patógeno en las células, especialmente cuando experimenta previamente patógeno y células tipo combinaciones4. Mientras que el estudio de la cascada de la respuesta celular después de la infección puede indicar invasión patógeno productiva, la combinación de datos de respuesta de imagen y celular es esencial para demostrar la infección y la invasión de patógenos. Mientras reportes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos con el Dr. Robert Heinzen para proporcionar reservas de expresar mCherry burnetii de la coxiella. Agradecemos a Dr. Luis Teixeira para proporcionar virus iridiscente invertebrados 6 y el centro de Stock de Bloomington para proporcionar a las poblaciones de la mosca. Este proyecto fue financiado en parte por NIH subsidio R00 AI106963 (A.G.G.) y Universidad Estatal de Washington.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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