Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen
Summary
Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.
Abstract
Die Hybridisierung Erfassung von Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics (HyCCAPP) Technologie wurde ursprünglich entwickelt, um neuartige DNA-Protein-Interaktionen in der Hefe zu entdecken. Es ermöglicht die Analyse von einer Zielregion of Interest ohne Vorkenntnisse über wahrscheinlich Proteine an der Zielregion gebunden. Das in der Theorie ermöglicht eine HyCCAPP verwendet werden, um eine genomische Region des Interesses zu analysieren, und bietet ausreichend Flexibilität in verschiedenen zellsystemen arbeiten. Diese Methode soll keine verbindliche Aufstellungsorte des bekannten Transkriptionsfaktoren, eine Aufgabe, die besser geeignet für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-ähnliche Methoden zu studieren. Die Stärke des HyCCAPP liegt in seiner Fähigkeit, DNA-Regionen zu erkunden, für die ist begrenzt, oder keine Kenntnisse über die Proteine, die mit ihm verbunden. Es kann auch eine bequeme Methode zur Vermeidung von Verzerrungen (vorhanden in ChIP-ähnliche Methoden) von Protein-basierten Chromatin Anreicherung mit Antikörpern eingeführt werden. Möglicherweise kann HyCCAPP ein mächtiges Werkzeug um wirklich neuartige DNA-Protein Interaktionen aufzudecken. Bisher wurde die Technologie vor allem Hefezellen oder hohe Kopie wiederholte Sequenzen in Säugetierzellen angewendet. Um das mächtige Werkzeug geworden, was, das wir uns vorstellen, müssen HyCCAPP Ansätze optimiert werden, um effizient Single Copy Loci in Säugetierzellen zu erfassen. Hier präsentieren wir Ihnen unsere Anpassung der ursprünglichen Hefe HyCCAPP Protokoll zum humanen Zelllinien zu erfassen, und zeigen, dass Single Copy Chromatin Regionen effizient mit dieser geänderten Protokoll isoliert werden können.
Introduction
In den vergangenen zehn Jahren hat es eine dramatische Verbesserung Sequenziertechnologien, so dass die Studie einer breiten Palette von Genomen in großer Zahl von Proben und mit erstaunlichen Auflösung gesehen. Die Enzyklopädie des DNA-Elemente (ENCODE) Consortium, eine groß angelegte Multi-institutionelle Anstrengung, angeführt von der National Human Genome Research Institute, der National Institutes of Health, lieferte Einblicke, wie die einzelnen Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine binden und interagieren mit dem Genom. Der Initiale Aufwand gekennzeichnet spezifische DNA-Protein Interaktionen wie Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) für über 100 bekannten DNA-bindende Proteine1bewertet. Alternative Methoden wie DNase Footprinting2 und Formaldehyd assistierten Isolation der regulatorischen Elemente (FAIRE)3 auch verwendet wurden, um bestimmte Regionen des Genoms Interaktion mit Proteinen, aber mit der offensichtlichen Einschränkung zu suchen, Diese experimentelle Ansätze kennzeichnen die interagierenden Proteine nicht. Trotz der umfangreichen Bemühungen in den letzten Jahren entstanden keine Technologie, die effizient die umfassende Charakterisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Chromatin, und die Identifizierung und Quantifizierung der Chromatin-assoziierte Proteine ermöglicht.
Zu diesem Zweck entwickelten wir einen neuartigen Ansatz, die wir als Hybridization Capture of Chromatin-Associated Proteine für Proteomics (HyCCAPP) bezeichnet. Ursprünglich entwickelt in Hefe4,isoliert5,6, der Ansatz querverbunden Chromatin Regionen von Interesse (mit gebundenen Proteine) mit Sequenz-spezifische Hybridisierung Capture. Nach Isolierung der DNA-Protein komplexe können Ansätze wie Massenspektrometrie verwendet werden, um den Satz von Proteinen gesprungen, um die Reihenfolge des Interesses zu charakterisieren. So kann HyCCAPP betrachtet werden, denn ein nicht voreingenommen Ansatz aufzudecken neuartige DNA-Protein Interaktionen, in dem Sinne, dass es nicht auf Antikörper und es setzt völlig agnostisch über die Proteine, die gefunden werden konnten. Es gibt andere Ansätze in der Lage, Roman DNA-Interaktion Proteine7zu entdecken, aber die meisten verlassen sich auf ChIP-ähnliche Methoden8,9,10, Plasmid Einfügungen11,12, 13,14, oder Regionen mit hohen Kopie Zahlen15. Im Gegensatz dazu HyCCAPP auf Multi und Single Copy Regionen angewendet werden kann, und es erfordert keine vorherige Informationen über die Proteine in der Region. Darüber hinaus, während einige der Methoden erwähnt oben haben wertvolle Funktionen, insbesondere die Notwendigkeit zu vermeiden, für DNA-Protein Vernetzungsreaktionen, die Besonderheit des HyCCAPP ist, dass es auf Single Copy Regionen angewendet werden kann Zellen unverändert und ohne Vorwissen über vermeintliche Bindeproteine oder verfügbaren Antikörper.
An dieser Stelle HyCCAPP überwiegend auf die Analyse der verschiedenen genomischen Regionen in Hefe4,5,6angewendet wurde, und wurde vor kurzem zur Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Alpha-Satelliten-DNA, einen Wiederholbereich analysieren im menschlichen Genom16. Im Rahmen unserer kontinuierlichen Arbeit haben wir die Hybridisierung Erfassung Ansatz ursprünglich entwickelt für Hefe Chromatin, werden für die Analyse der menschlichen Zellen, und präsentieren Ihnen hier eine modifizierte Protokoll, das die selektive Erfassung der Single Copy Ziel ermöglicht angepasst Regionen des menschlichen Genoms mit Wirkungsgraden ähnlich wie unsere ersten Studien in der Hefe. Dieses neue optimierte Protokoll erlaubt nun die Anpassung und Nutzung der Technologie, DNA-Protein Interaktionen über das menschliche Genom, mit Massenspektrometrie oder anderen analytischen Ansätzen zu befragen.
Es ist wichtig zu betonen, dass die HyCCAPP-Methode für die Analyse der spezifischen Zielregionen soll und noch nicht geeignet für genomweite Analysen. Die Technologie ist besonders nützlich beim Umgang mit Regionen knappe Informationen über interagierenden Proteine besteht, oder wenn eine umfassendere eingehende Analyse der interagierenden Proteine auf eine spezifische Genom-Locus gewünscht wird. HyCCAPP soll entdecken Sie DNA-bindende Proteine aber nicht charakterisieren genau die spezifischen Proteins Bindungsstellen in der genomischen DNA. In der aktuellen Implementierung bietet die Methode keine Informationen über die Bindung von DNA-Sequenzen oder Motive für einzelne Proteine. Daher, es schön ergänzt vorhandene Technologien wie FAIRE und ermöglicht die Identifizierung von neuartigen Bindeproteine genomische Regionen durch eine Erstanalyse FAIRE identifiziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode der HyCCAPP hat viele einzigartige Features, die es machen einen leistungsfähigen Ansatz DNA-Wechselwirkungen aufzudecken, die sonst schwer fassbaren bliebe. Die Natur des Prozesses bietet HyCCAPP die Flexibilität, in verschiedenen Organismen und Regionen des Genoms zu arbeiten. Es ist eine Methode, das hat jedoch einige Einschränkungen zu beachten.
HyCCAPP ist eine Methode, die Zelle Änderungen verhindert, so dass sie möglicherweise in Primärzellen, Zellkul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch NIH-Stipendien-P50HG004952 und R01GM109099, MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
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