Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için
Summary
Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.
Abstract
Hibridizasyon yakalama proteomik (HyCCAPP) teknoloji için Kromatin ilişkili proteinlerin başlangıçta Maya roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir. Analiz bir hedef bölgenin ilgi büyük olasılıkla proteinler hedef bölgesine bağlı hakkında ön bilgi için gerek kalmadan sağlar. Bu, teorik olarak, HyCCAPP ilgi genomik herhangi bir bölge analiz etmek için kullanılacak sağlar ve farklı hücre sistemlerinde çalışmak üzere yeterli esneklik sağlar. Bu yöntem bağlayıcı siteleri bilinen transkripsiyon faktörleri, kromatin Immunoprecipitation (ChIP) ve çip benzeri yöntemleri için daha uygun bir görev çalışma gerekiyordu değildir. HyCCAPP gücü var olan sınırlı DNA bölgeleri keşfetmek için onun yetenek ya da kendisine bağlı proteinler hakkında hiçbir bilgi yatıyor. O da önyargıları (ChIP benzeri yöntemleri mevcut) antikorları kullanarak protein bazlı kromatin zenginleştirme tarafından tanıtılan önlemek için uygun bir yöntem olabilir. Büyük olasılıkla, HyCCAPP gerçekten roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olabilir. Bugüne kadar teknoloji ağırlıklı olarak Maya hücreleri veya yüksek kopya memeli hücreleri tekrar serilerinde uygulanmıştır. Biz öngörülüyor güçlü bir araç haline için HyCCAPP yaklaşımlar verimli bir şekilde tek kopya loci memeli hücrelerinde yakalamak için optimize edilmiş olması gerekir. Burada, bizim adaptasyon HyCCAPP Protokolü insan hücre hatları için yakalama ve tek kopya kromatin bölgeleri bu değiştirilmiş protokolü ile verimli bir şekilde izole olabilir göstermek ilk Maya mevcut.
Introduction
Son on yılda, orada sıralama teknolojileri, çok sayıda örnekleri ve şaşırtıcı çözünürlük ile Genom geniş bir çalışma izin dramatik bir artış gördü. DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) Konsorsiyumu, Ulusal insan Genomu Araştırma Enstitüsü tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri önderliğinde büyük ölçekli bir çok kurumsal çaba nasıl bireysel transkripsiyon faktörleri anlayışlar sağlamıştır ve diğer düzenleyici proteinler bağlamak ve genom ile etkileşim. İlk çaba belirli DNA-protein etkileşimleri, kromatin immunoprecipitation (ChIP) tarafından 100’den fazla bilinen DNA’ya bağlanıcı proteinler1için değerlendirildi olarak karakterize. DNaz footprinting2 ve formaldehit düzenleyici elemanlarının (dürüst)3 destekli yalıtım proteinler, ama bariz sınırlama ile etkileşim genom belirli bölgelerinde bulmak için de kullanılmıştır gibi alternatif yöntemler bu Bu deneysel yaklaşımlar etkileşen proteinler tanımlamak değil. Son yıllarda yoğun çabalara rağmen hiçbir teknoloji protein-DNA etkileşimleri kromatin, ve kimlik kapsamlı karakterizasyonu ve miktar kromatin ilişkili proteinlerin verimli bir şekilde sağlayan ortaya çıkmıştır.
Bu gereksinimi karşılamak için proteomik (HyCCAPP) için Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteinleri olarak adlandırılan yeni bir yaklaşım geliştirdik. Başlangıçta Maya4‘ te,geliştirilen5,6, yaklaşım fingerprinting hibridizasyon yakalama kullanarak çapraz kromatin bölgeleri (ile ilişkili proteinler) ilgi izole ediyor. Protein-DNA komplekslerinde izolasyon sonra yaklaşımlar kütle spektrometresi gibi proteinlerin faiz dizisine bağlı karakterize etmek için kullanılabilir. Böylece, antikorlar ve bu dayanmaz anlamda roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için olmayan önyargılı bir yaklaşım bulunabilir proteinler hakkında tamamen agnostik olduğu gibi HyCCAPP kabul edilebilir. Orada diğer yaklaşımlar roman proteinler7DNA etkileşim ortaya çıkarmak, ama en küçük parça benzeri yöntemleri8,9,10, plazmid eklemeleri11,12etmek yeteneğine sahip, 13,14veya bölgelerde yüksek kopya sayıları15ile. Buna ek olarak, HyCCAPP çok ve tek kopya bölgelere uygulanabilir ve bu bölgedeki proteinler hakkında önceden herhangi bir bilgi gerektirmez. Buna ek olarak, bazı yöntemler yukarıda var değerli özellikler, DNA-protein çapraz reaksiyonlar, HyCCAPP benzersiz özelliği için bu tek kopya bölgelere uygulanabilir özellikle ihtiyaç kaçınarak değiştirilmemiş hücreleri belirtilen süre ve herhangi olmadan sözde proteinler veya kullanılabilir antikorlar hakkında ön bilgi.
Bu noktada, HyCCAPP ağırlıklı olarak Maya4,5,6farklı genomik bölgelerde Analizi uygulandı ve son Alfa-uydu DNA, tekrar bir bölge protein-DNA etkileşimleri analiz etmek için kullanılan insan genom ‘16. Bizim devam eden çalışmaları kapsamında, başlangıçta insan hücreleri analiz için geçerli olabileceğini ve burada tek kopyası hedef seçici yakalama sağlayan değiştirilmiş bir protokol sunmak Maya kromatin için geliştirilen hibridizasyon yakalama yaklaşım adapte olması insan genomu ile verimliliği ilk çalışmalarımız Maya benzer bölgelerde. Bu yeni en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Şimdi uyum ve kütle spektrometresi veya diğer analitik yaklaşımlar kullanarak insan genomu arasında protein-DNA etkileşimleri sorgulamaya teknoloji kullanımı sağlar.
HyCCAPP yöntemi hedef bölgeleri analiz için tasarlanmıştır ve henüz genom çapında analizleri için uygun değildir vurgulamak önemlidir. Teknoloji özellikle var olan etkileşen proteinler hakkında az bilgi bölgeleri ile ilgili ya da daha kapsamlı bir derinlemesine analiz, belirli genom locus etkileşen proteinlerin istendiğinde yararlıdır. HyCCAPP DNA’ya bağlanıcı proteinler ortaya çıkarmak ama doğru bir şekilde genomik DNA belirli protein bağlayıcı siteleri niteleyen değil içindir. Onun geçerli uygulama, metodoloji DNA bağlayıcı sıraları veya bireysel proteinler için motifleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, bu güzel FAIRE gibi varolan teknolojileri tamamlar ve kimliği roman proteinler genomik bölgelerde ilk FAIRE Analizi tarafından tanımlanan izin verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan HyCCAPP yöntemi aksi takdirde zor kalacaktı DNA etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir yaklaşım yapmak birçok benzersiz özelliğe sahiptir. Sürecinin niteliğini HyCCAPP farklı organizmalar ve genom bölgelerinde çalışmak için esneklik sağlar. Bu bir yöntemdir, ancak, bu bazı sınırlamaları dikkate alınacak.
HyCCAPP hücre değişiklikleri önler, böylece potansiyel olarak primer hücre, hücre kültür sistemleri veya hatta doku örnekleri uy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH hibe P50HG004952 ve R01GM109099 için Mo tarafından desteklenmiştir
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
